[发明专利]一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法

权利要求书

1.一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特征在于：具 体包括以下步骤：

1)RNA的提取

①选取同一批次出壳的云南地方鸡的健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于 4、8、12周龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集 的组织进行低温冷冻，将低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵 中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；加入RNAisoPlus；

②将匀浆液转移至离心管中；

③向匀浆裂解液中加入RNAisoPlus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖， 混合至溶液乳化呈乳白色；

④室温静置5分钟；

⑤在4℃条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三 层，即：无色的含RNA上清液、中间的含DNA的白色蛋白层及带有颜色的下层 有机相；

⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；

⑦4℃条件下离心10分钟；

2)RNA沉淀的清洗

弃去上清液，加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，上下颠倒洗涤离心 管管壁，在4℃条件下离心5分钟后小心弃去上清液；

3)RNA的溶解

打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉 淀，最后将RNA溶液贮存于-80℃；

4)总RNA纯度、浓度及完整性检测

取1μL总RNA溶于99μL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA 在OD260nm、OD280nm的吸光值，并求出两者的的比值；

5)总RNA电泳检测

取3μL总RNA样品经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪 下观察电泳结果；

6)PCR引物设计

根据GenBanK中原鸡(Gallusgallus)的相关基因序列，使用引物设计软件 primer5.0设计引物，并合成，合成后进行荧光定量PCR；引物序列为F:5’ -GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3’；R:5’-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3’；

7)检测LEAP-2基因的表达量

检测云南四个地方鸡种肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中LEAP-2基因 的表达量，荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，65℃ 退火30s、72℃延伸30s，40个循环。

2.根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方 法，其特征在于：在步骤1)总RNA的提取①中加入RNAisoPlus的量为1ml。

3.根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方 法，其特征在于：在步骤1)总RNA的提取③中加入RNAisoPlus体积量1/5 的氯仿。

4.根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方 法，其特征在于：在步骤1)总RNA的提取⑤中溶液分层为三层，三层分别为： 无色含RNA的上清液、白色的中间蛋白层及带有颜色的下层有机相。

5.根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方 法，其特征在于：步骤6)PCR引物设计中用于荧光定量的LEAP-2基因的引物 序列为：

F:5’-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3’

R:5’-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3’

内参18SrRNA的引物序列为：

F:5’-TGGACTCCTACAACCAACGG-3’

R:5’-CATCCTCCTTGAACTCGCAG-3’

荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，65℃退火 30s、72℃延伸30s，40个循环。

6.根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方 法，其特征在于：所述的云南地方鸡包括武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围 山微型鸡。