[发明专利]一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物分子育种的基因工程技术领域，具体涉及一种基于LEAP-2 基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法。

背景技术

免疫抗病研究是现代家禽育种研究的一大热点。家禽的品种、养殖环境、 饲料等都会在实际生产过程中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有 免疫代谢能力在机体抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位。所以，准确认 识动物机体免疫器官在不同时间阶段免疫相关基因的表达特性，是免疫抗病研 究的基础。

抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的多肽，是机体先天免疫系统中 防御病菌入侵的重要成分。Ⅱ型肝表达抗菌肽(Liverexpressedantimicrobial peptide2，LEAP-2)是近年来在脊椎动物中发现的一种新型抗菌肽，其氨基酸序 列、二级结构及表达模式等与已知肽类均不相同，并具有较强的抗微生物活性。 LEAP-2基因编码94个氨基酸残基组成的多肽；氨基端的信号肽由28个残基组 成，成熟肽含有41个残基。人LEAP-2基因包含3个外显子和2个内含子，只 有1个拷贝。通过放射性杂交作图发现LEAP-2基因位于5号染色体的长臂3区 1带，编码77个氨基酸残基组成的前体蛋白质，多分布于肝脏。鼠类LEAP-2 基因也是由3个外显子和2个内含子组成的。Northern印迹分析确认肝和小肠是 鼠表达LEAP-2的主要器官。在鸡体内分离得到的LEAP-2是首次发现于非哺 乳动物的LEAP-2，它含有76个氨基酸残基，与人的LEAP-2序列有59％同源 性，C端含有2对二硫键，该基因位于第13号染色体，有3个外显子和2个内 含子。LEAP-2作为抗菌肽的一种，对保护禽类免受微生物影响具有重要作用， 它能通过破坏细胞膜，干扰代谢等方式杀死细菌、真菌、寄生虫、病毒等，并 在先天性免疫中通过调节趋化因子和细胞因子的活性发挥作用。

发明内容

本发明提供一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，采 用分子生物学技术和生物信息学分析方法，在对云南地方鸡LEAP-2基因mRNA 表达量的研究中发现LEAP-2基因与免疫功能相关，通过云南地方鸡LEAP-2基 因mRNA在云南地方鸡的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量，判 断云南地方鸡免疫机能的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表 达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化和被病原微生物感染，在肝脏、脾脏、 胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。

为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：

所述的基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法包括以下具体 步骤为：

1)RNA的提取

①选取同一批次出壳的四个品种(武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山 微型鸡)健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄屠宰，采集各个 鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温 冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不 断加入液氮，直至研磨成粉末状；加入1mlRNAisoPlus(宝生物公司)。

②将匀浆液转移至离心管中；

③向匀浆裂解液中加入RNAisoPlus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖， 混合至溶液乳化呈乳白色；

④室温静置5分钟；

⑤在4℃条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三 层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带 有颜色的下层有机相；

⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；

⑦4℃条件下离心10分钟；

2)RNA沉淀的清洗

弃去上清，加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离 心管管壁，在4℃条件下离心5分钟后小心弃去上清；

3)RNA的溶解

打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀， 最后将RNA溶液贮存于-80℃；

4)总RNA纯度、浓度及完整性检测