[发明专利]一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒

权利要求书

1.一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照重组蛋白、检测抗体、显色底物和终止液；

所述酶标记板上的包被抗体为DV14抗体，所述的DV14抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；

所述的阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清；

所述的阳性对照重组蛋白包括四种型别的NS1重组蛋白；

所述的四种型别的NS1重组蛋白的制备方法均是将登革病毒标准株经RT-PCR扩增后，与pMD19T载体连接，连接产物与pET30a经BamHI和NotI双酶切后，胶回收，T4DNA连接酶连接回收产物，然后再转到大肠杆菌BL-21中，通过表达纯化，得到相应型别的NS1重组蛋白；

所述的登革病毒标准株包括I-IV型登革病毒标准株；

所述的检测抗体为连接了生物素的DV11抗体，所述的DV11抗体的氨基酸序列如SEQIDNo.2；

所述的显色底物包括酶标亲和素抗体和TMB显色液；所述的酶标亲和素抗体为HRP标记的羊抗小鼠二抗；

所述的终止液为2M的硫酸。

2.根据权利要求1所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的DV14抗体的制备方法为：将如SEQIDNo.1的氨基酸序列编码的多肽DV14与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。

3.根据权利权利要求2所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述的DV14抗体的制备方法为：将多肽DV14与牛血清蛋白连接后，得到DV14-BSA抗原；

用生理盐水将DV14-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV14-BSA的浓度为1μg/μl，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠免疫100μl的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为100μg；然后分别在第21天、第35天、第49天后用相同的办法进行第二次、第三次以及第四次免疫；经四次免疫过后，取小鼠脾细胞，按1：4（v/v）的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为10⁷个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清，然后在37℃水浴中于1分钟内边摇边滴加1ml的50%（v/v）PEG-1400的GKN溶液，滴加完后于2分钟内再加入20ml预热至37℃的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10%（v/v）胎牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μl加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37℃、5%CO₂培养箱中培养，12h后，把含10%（v/v）胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培养基，同样条件下培养，每隔2天换一次新的HAT选择培养基，待细胞长至39-41%的时候，把含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV14单克隆细胞株；

选取6-8周龄的BALB/c小鼠提前一周用石蜡油来致敏小鼠，注射2ml的10⁶个/ml的DV14单克隆细胞株来制备腹水，最后采用Millpore公司MontageAntibodypurificationkit试剂盒来纯化腹水，得到包被抗体DV14。

4.根据权利权利要求2所述的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记板的制备方法是：将所述的包被抗体DV14用包被缓冲液稀释到2.5μg/ml后，按100μl/孔包被到酶标记板的微孔内，在4℃条件下，将酶标记板置于湿盒中反应24小时后，用PBST洗板，每孔PBST用量为0.25ml，在4℃下，按每孔200μl放入3%（m/v）的脱脂奶粉封闭酶标记板，封闭24小时后，弃除多余的封闭液，置4℃保存，即得到酶标记板；

所述的包被缓冲液的pH为9.6，每1000ml包被缓冲液中含Na₂CO₃1.59g、NaHCO₃2.93g；

所述的PBST为含有0.05%（v/v）吐温20的磷酸缓冲液；

所述的3%（m/v）的脱脂奶粉为以PBST为溶剂，以脱脂奶粉为溶质配成的溶液。