[发明专利]一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种I-IV型登革热病毒的通用检 测试剂盒。

背景技术

登革病毒(Dengusvirus，DENV)登革病毒属于黄病毒科黄病毒属中的一 个血清型亚群，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以 及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。世界卫生组织将感染 了登革病毒患者的临床症状分类为登革热(DF)、登革出血热(DH)和登革休 克综合征(DSS)。感染患者表现出在持续高热2-7天，并伴有头痛，全身乏力， 恶心，呕吐，肌肉痛和腹痛。近年来，由于全球气候变暖、人口流动频繁等因 素，登革热的爆发和流行范围有逐年扩大和愈演愈烈之势，其在全球的发病率 提高了近30倍。在过去两年中，在地处热带和亚热带地区的东南亚、美洲以及 西太平洋地区，超过100个国家的25亿人受到登革病毒的威胁，在2009-2013 年间每年全球登革热、登革出血热的发病数均达3.9亿。2015年，截止10月1 0日仅在中国云南省西双版纳州累计报告登革热病例超过398例。登革热是过去 50年间世界上最为严重的传染病之一，已成为严重的全球性公共卫生问题，不 仅严重危害人类的健康，还为国家和个人带来沉重的经济负担。

目前由于登革热治疗的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市。所以登 革热的诊断对预防和治疗登革热起到了至关重要的作用。在常规诊断方法主要 包括三种，(1)RT-PCR法：登革病毒检测的方法常规用的是分离病毒后，通 过RT-PCR来检测；(2)登革病毒抗体IgM和IgG抗体ELISA检测法；(3) 登革病毒NS1抗原的检测法。在这三种检测方法中，RT-PCR法为最经典的检测 方法，但是由于其操作时间长，成本也最高，所以不太适合临床大量样本的处 理和检测。而第二种登革病毒抗体IgM和IgG抗体ELISA检测法，虽然其具有 特异性、敏感性以及稳定性较高的特点，但其只有在登革病毒感染5-7天后才能 检测出来。第三种NS1抗原检测法与第二种方法相比，能在最初感染的时候被 检测出来，对于登革热的早发现、早干预及早治疗具有重要意义。而且NS1抗 原的检出浓度对于登革热患者的预后具有重要的指导意义。但目前的NS1抗原 的ELISA检测试剂盒中的包被抗体和检测抗体，其来源大多都为天然NS1抗体 免疫后所得的抗体，由于登革病毒有四个型别，所以其抗体的制作过程会相对 复杂，成本也会相应的有所提高。因此，制作操作简单、早期检测、快速准确 且成本低的新型的登革病毒NS1抗原的ELISA检测试剂盒对于普通人民有着重 要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种基于登革病毒非结构 蛋白NS1特异表位肽的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，通过检测血清中 登革病毒中的非结构蛋白NS1，可对早期感染登革热的病人进行早期诊断和最 后的确诊，还可以通过检测非结构蛋白NS1的量来指导病人的病情。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，包括酶标记板、阴性对照血清、 阳性对照重组蛋白、检测抗体、显色底物和终止液；

所述酶标记板上的包被抗体为DV14抗体，所述的DV14抗体的氨基酸序列 如SEQIDNo.1所示；

所述的阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清；

所述的阳性对照重组蛋白包括四种型别的NS1重组蛋白；

所述的四种型别的NS1重组蛋白的制备方法均是将登革病毒标准株经RT- PCR扩增后，与pMD19T载体连接，连接产物与pET30a经BamHI和NotI 双酶切后，胶回收，T4DNA连接酶连接回收产物，然后再转到大肠杆菌BL-2 1中，通过表达纯化，得到相应型别的NS1重组蛋白；

所述的登革病毒标准株包括I-IV型登革病毒标准株；

所述的检测抗体为连接了生物素的DV11抗体，所述的DV11抗体的氨基酸 序列如SEQIDNo.2；

所述的显色底物包括酶标亲和素抗体和TMB显色液；所述的酶标亲和素抗 体为HRP标记的羊抗小鼠二抗；

所述的终止液为2M的硫酸。

进一步，优选的是所述的DV14抗体的制备方法为：将如SEQIDNo.1的 氨基酸序列编码的多肽DV14与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。