[发明专利]一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法

说明书

本发明公开了一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，包括以下步骤：步骤1：病原菌的培养；步骤2：产孢装置；步骤3：接种叶片；步骤4：分生孢子的诱导：3d左右以后，当菌丝侵染叶片形成明显肉眼可见的病斑后，随即去除菌饼，继续喷雾保湿，于接种后6d左右在病斑处产孢，10d后每个叶片上产生的分生孢子达10⁴个左右，分生孢子产生后若要使用应及时将其用无菌水洗下，每个产孢的叶片用移液器吸取1mL无菌水进行冲洗即可，每个叶片可得到1mL的分生孢子悬浮液。与现有技术相比，本发明的有益效果为：在较短的时间内获得可供科学试验研究的槭菌刺孢的分生孢子，确保试验的稳定性、可操作性和可重复性。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法。

背景技术

槭菌刺孢Mycocentrospora acerina(R.Hartig)Deighton[＝Centrosporaacerina(R.Hartig)A.G.Newhall]，其分类地位为子囊菌门Ascomycota座囊菌纲Dothideomycetes球腔菌科Mycosphaerellaceae菌刺孢属Mycocentrospora，可寄生于淡水流域的沉水植物上也侵染陆地寄主植株引起植物病害，该菌寄主范围广泛，危害严重，在国外主要引起三色堇叶斑病、欧芹储藏期腐烂病、胡萝卜根腐病、牛蒡溃疡病及冠腐病等病害，该病原于上世纪90年代初传入我国，侵染药用植物细辛，引起细辛叶枯病。据调查报道1993年开始侵染三七植株，导致三七圆斑病，此后三七圆斑病逐年扩大，目前已成为三七病害中的重要叶部病害之一。

三七(Panaxnotoginseng)为五加科人参属多年生草本宿根植物，是一种原产我国的名贵中药材，在传统露天荫棚的三七种植园中三七圆斑病在雨季普遍发生，一旦发病，从开始发病到发病高峰期病程短，发病迅猛、毁灭性强，常年平均发病率在30％左右，雨季来临时若管理不善发病率可高达60％以上，严重时发病率高达70％以上，甚至毁园。因此，槭菌刺孢是一种重要的病原。随着三七生产种植范围的逐年扩大，该病的发生也愈加普遍，在化学防治方面，每年的农药施用量也出现了增加，该病原是否发生了变异未有相关报道。目前暂无关于槭菌刺孢侵染三七的病理学报道，由于其分生孢子的人工诱导不易，从而滞后了槭菌刺孢Mycocentrospora acerina分类学和生物学等领域的研究进展。

槭菌刺孢分生孢子的产生方式特殊，其分生孢子的诱导一直以来都是难题，槭菌刺孢在人工培养基上不易产生分生孢子，偶见国外学者报道槭菌刺孢在人工培养基如(PDA、1/4PDA、V8汁培养基等)上可产生分生孢子的研究报道，但并没有详细的描述；而国内学者则普遍认为槭菌刺孢在人工培养基上不能产生分生孢子。虽然已有文献报道了多种产孢方法可诱导分生孢子 的产生，但都存在局限性、重复性差、产孢量少等问题。

现有已报道的槭菌刺孢的产孢技术方案：

①翻转培养基法：有学者认为将已长满菌落的培养基翻转，使菌丝穿过培养基生长可以产生分生孢子。

②新鲜罹病组织保湿法：Neergaard(1951)将田间发病植株的罹病组织才回室内后，取小块罹病组织保湿培养，可产生大量的分生孢子。

③低温紫外培养法：Lawrie(1999)将培养在PDA平板上的槭菌刺孢菌落经低温18℃紫外光连续照射培养10d后可产生大型分生孢子。

④菌块水滴保湿法：傅俊范(1995)采用PDA或V8汁培养基平板菌块切割，水滴保湿培养方法，成功诱导了分生孢子的产生，但并未说明产生了多少分生孢子，陆宁(2005)年采用此方法在18℃全光照的条件下48h诱导了47个分生孢子。

⑤胡萝卜产孢法(此方案是与本技术发明最相近似的方案)：Louarn(2012)将槭菌刺孢菌饼接至经高温蒸汽灭菌的胡萝卜主根上，于装有100mL无菌水的无菌锥形瓶中20℃培养3周后产生分生孢子。

现有技术的产孢技术方案的缺陷为：