[发明专利]胸苷激酶1的荧光免疫层析检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种胸苷激酶1的检测方法及试剂盒，尤其涉及胸苷激酶1的荧 光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

胸苷激酶1，又称TK1，是癌变细胞DNA合成必需的前体物，是调控细胞合 成的特殊酶，其含量与细胞异常增殖紧密相关。肿瘤是一种细胞异常增殖的慢 性疾病，是体内的正常细胞在环境因素影响下增生与异常分化形成的癌细胞， 癌细胞不断增多就形成了实体瘤，不过这个过程很漫长，往往要通过几年时间 达到一定的大小后才可以通过CT等检测设备检测出来。TK1就是在细胞癌变初 期就可以检测到这些变化，进而在形成实体瘤之前就进行风险预警。TK1的检测 方式是抽取人体血液进行检测得出相应的TK1值，根据TK1值来评估罹患肿瘤的 风险。

TK1催化胸苷(TdR)为1-磷酸胸苷酸(TMP)，是细胞周期依赖酶，主要 存在于细胞质中。当机体出现大量增殖细胞时，TK-1的水平迅速升高。一旦发 生癌变，伴随着肿瘤细胞的急剧增殖，机体内TK-1的活性及含量都将升高，可 超过正常水平的20～100倍。TK1是国际公认的细胞异常增殖标记物，它对检测 血清中胸苷激酶1(STK1)的水平、动态了解体内癌细胞的增殖活动信息、评估 肿瘤的治疗效果有着重要作用，能更早预示肿瘤复发风险。因此TK1的检测可用 于评估手术效果、监测化疗效果、预测复发风险、判断肿瘤预后等。目前国内 国外开发的TK1试剂盒多采用酶免疫方法，酶免疫方法检测操作复杂，人为操作 易导致结果误差，机器操作需要昂贵的生化仪器，且检测时间长，检测少量样 本时成本较高。

现有技术荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，是免疫荧光技术和 传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术。该技术在保留胶 体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪 增强技术实现了检测结果的精确定量，方便对物质进行定性或定量分析，具有 高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。其原理是将特异的抗体先 固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由 于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样 品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，采用免疫胶体金等可使该区域显 示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

中国专利CN101231288B公开了一种基于磁性纳米微粒的荧光免疫定量检 测TK1的试剂盒，通过将TK1固定于氨基硅烷化的超顺磁性纳米颗粒固定化载体 表面，采用竞争法，以辣根过氧化物酶为酶标记、对羟基苯丙酸为荧光底物， 实现TK1的检测。然而该方法在检测时需要的免疫反应时间较长，待测TK1先与 酶标记的TK1单克隆抗体反应，再加入TK1包被的磁性微球发生竞争反应，洗涤 后在磁场下分离，最后加入荧光底物进行显色并测量，检测所需步骤较长，过 程约1.5～3h。

中国专利CN101275954B公开了一种利用免疫层析法简便测定TK1的预警芯 片，由包被有一抗TK1单克隆抗体的条状纤维层析固相载体NC膜、滤样纸、吸 水玻璃纤维纸、标记有胶体金的二抗TK1单克隆抗体结合物的聚酯膜粘贴在PVC 塑料片组成，该方法检测简单，然而并不能准确定量TK1，对TK1在癌症治疗过 程监控不能提供明确的数据。

因此，如何开发检测时长短、操作方便、检测结果精确的TK1检测方法和检 测产品成为亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操 作简单、成本低的胸苷激酶1的检测方法及试剂盒。

本发明一种胸苷激酶1的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤：

步骤1)探针固定垫制备：将胸苷激酶1单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧 光胶乳微粒偶联反应制得胸苷激酶1单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述胸苷激 酶1单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混 合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻 璃纤维上制得探针固定垫；

步骤2)免疫层析试纸条制备：将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依 次贴在PVC衬板上，将所述胸苷激酶1单克隆抗体包被在层析膜的检测线上， 将所述羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条，所述层 析膜优选硝酸纤维素膜；