[发明专利]一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法及其应用

权利要求书

1.一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法，其特征在于，该法基于BiFC系统，以克隆的方式，构建SUMO1、SUMO2/3的C端或N端连接YFPn的逆转录表达载体，将待检测对象的多个基因的cDNA克隆入含有YFPc的逆转录表达载体；病毒感染后，将同时稳定表达以下融合蛋白：SUMO1cvn-YFPn和待筛选基因-YFPc、SUMO2/3C-YFPn和待筛选基因-YFPc、SUMO1nvn-YFPn和待筛选基因-YFPc、SUMO2/3nvn-YFPn和待筛选基因-YFPc；如果SUMO底物和SUMO发生相互作用，则可在FITC波长下观察到发荧光信号，即筛选出活细胞内SUMO修饰底物；

其中，所述构建SUMO1、SUMO2/3的C端或N端连接YFPn的逆转录表达载体的策略是：

当需要同时检测与SUMO发生共价和非共价相互作用的蛋白时，则在SUMO1、SUMO2/3的cDNA序列的N端上连接YFPn；

当需要检测与SUMO发生非共价相互作用的蛋白时，则在SUMO1、SUMO2/3的cDNA序列的C端上连接YFPn。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.构建YFPc-X病毒库：将待检测对象的多个基因克隆入含YFPc的逆转录病毒表达载体pB-CMV-NC/CC-puro中，获得若干个含YFPc的质粒；然后将含YFPc的质粒分为若干个库，每个库含等量的不同质粒，再将这若干个质粒库进行YFPc-X逆转录病毒的包装，获得对应的若干个病毒库；

S2.构建YFPn-SUMO稳定表达细胞系：将SUMO1、SUMO2/3的cDNA亚克隆融合到逆转录病毒表达载体pB-CMV-CVN/VN-neo中，获得SUMO与YFPn的融合蛋白真核表达载体，进一步构建得到YFPn-SUMO稳定表达细胞系；

S3.构建YFPn-SUMO与YFPc-X共表达的稳定细胞系：将S1所述若干个病毒库分别感染YFPn-SUMO稳定表达细胞系，感染后筛选出YFPn-SUMO与YFPc-X共表达的细胞群；

S4.BiFC筛选：对YFPn-SUMO与YFPc-X共表达的细胞群进行非诱导条件下的相互作用筛选或诱导条件下的相互作用筛选，收集BiFC阳性细胞，扩大培养后提取mRNA，进行PCR扩增，然后进行高通量测序并进行生物信息学数据分析，确定不同文库序列对应的蛋白底物信息，从而筛选SUMO共价和非共价修饰的蛋白底物；

其中，步骤S2所述将SUMO1、SUMO2/3的cDNA亚克隆融合到逆转录病毒表达载体pB-CMV-CVN/VN-neo中的策略是：

当需要同时检测与SUMO发生共价和非共价相互作用的蛋白时，则在SUMO1、SUMO2/3的cDNA序列的N端上连接YFPn；

当需要检测与SUMO发生非共价相互作用的蛋白时，则在SUMO1、SUMO2/3的cDNA序列的C端上连接YFPn。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S4所述PCR所用引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示引物；

步骤S4所述生物信息学数据分析的方法是：采用单端保留的方法对双端测序的结果进行数据分析，确定不同文库序列对应的蛋白底物信息，从而筛选SUMO共价和非共价修饰的蛋白底物。