[发明专利]一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质研究技术领域。更具体地，涉及一种高通量检测活细胞内 SUMO修饰底物的方法及其应用。

背景技术

小类泛素修饰因子(SmallUbiquitin-likeModifier，SUMO)是一种可以通过 异肽键修饰其他蛋白质的小分子多肽，SUMO化是蛋白质翻译后修饰的一种重 要方式，是在动物中发现的类似于泛素的蛋白质修饰方式。SUMO分子在进化 中高度保守，广泛存在于原生动物、后生动物、植物和真菌中，现已发现4种哺 乳动物的SUMO分子，分别为SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4，其中， SUMO2、SUMO3氨基酸序列非常接近，常合写为SUMO2/3，SUMO4是新近发 现的第四种SUMO分子。

在SUMO通路酶的作用下，SUMO分子可以被连接在特定蛋白上，通过这 种方式，SUMO影响靶蛋白的定位、稳定性、活性等生化特性，从而调控包括 转录、mRNA代谢、信号传导、核组装、DNA损伤修复等重要生物学通路。研 究表明，SUMO化还与多种疾病息息相关，例如I型糖尿病、帕金森、老年痴呆、 心脏病以及癌症等。因此，SUMO化一直是近些年翻译后修饰研究的热点。研 究SUMO和靶蛋白的相互作用对其影响相关通路的探索显得尤为重要。目前， 已知SUMO可以以共价和非共价的方式修饰底物，这两种作用均是其行使功能 的重要方式。针对SUMO的共价修饰，对于SUMO修饰底物的常见检测方法为 酵母双杂交系统、免疫沉淀与质谱分析，但是这两种方法均具有明显的缺陷。酵 母双杂交系统：(1)假阳性发生较为频繁，90％结果为假阳性；(2)双杂交系 统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内，因此并不能适用 于所有蛋白；(3)双杂交系统是基于转录的筛选系统，不适用于转录激活因子 相互作用蛋白的筛选。免疫沉淀与质谱分析：(1)免疫沉淀需要富集足够多的 蛋白，因此采用该方法需要大量细胞，需求细胞的数量一般为10⁸左右；(2) 免疫沉淀适合研究有稳定相互作用的蛋白复合体，但不能用来检测蛋白的瞬时相 互作用；(3)免疫沉淀与质谱分析背景信号高，灵敏度低。

因此，双杂交系统和免疫沉淀与质谱分析这两种方法都不适用于检测蛋白的 瞬时和微弱的相互作用。而针对SUMO的非共价修饰，目前尚无任何方法可以 单独鉴定出非共价修饰的方式。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有鉴定SUMO共价修饰底物的灵敏度不 足的缺陷，以及弥补鉴定SUMO非共价修饰底物方法的空白，提供一种可同时 检测特定蛋白共价和非共价修饰底物的检测方法，用于筛选在刺激或非刺激条件 下与目的蛋白相互作用的蛋白网络，筛选在刺激和非刺激下SUMO共价或非共 价修饰底物的结合情况，可筛选SUMO弱结合的蛋白底物，信噪比灵敏度高、 假阳性低。

本发明的目的是提供一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法。

本发明另一目的是上述高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法在检测 活体细胞内SUMO共价和/或非共价修饰底物方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种高通量检测活细胞内SUMO修饰底物的方法，该法基于BiFC系统，以 克隆的方式，构建SUMO1、SUMO2/3的C端、N端连接YFPn的逆转录表达载 体(4个文库)，将待检测对象的多个基因(21000个人类基因)的cDNA克隆 入含有YFPc的逆转录表达载体。病毒感染后，将同时稳定表达以下融合蛋白： SUMO1cvn-YFPn和待筛选基因-YFPc、SUMO2/3C-YFPn和待筛选基因-YFPc、 SUMO1nvn-YFPn和待筛选基因-YFPc、SUMO2/3nvn-YFPn和待筛选基因-YFPc； 如果SUMO底物和SUMO发生相互作用，通过流失细胞仪在FITC波长下观察 到发荧光的并检测信号强弱；该法可同时筛选SUMO1/2/3发生共价修饰和非共 价修饰的蛋白底物，主要用于筛选在刺激和非刺激下SUMO共价或非共价修饰 底物的结合情况，可筛选SUMO弱结合的蛋白底物，信噪比灵敏度高、假阳性 低。

其中，将SUMO1、SUMO2/3的cDNA亚克隆融合到逆转录病毒表达载体 pB-CMV-CVN/VN-neo中的策略是：