[发明专利]一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用，属于生物工程领域。

背景技术

L-亮氨酸又称白氨酸，即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基异己酸，与缬氨酸、异亮氨酸同属于支链氨基酸，是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一。

L-亮氨酸具有多种生理功能，是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对维持危重病人的营养需要、抢救患者生命起着积极作用。另外，L-亮氨酸在食品、化妆品、农业上也具有广泛的应用。

L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法。微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，是L-亮氨酸的主要生产方法。目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道。通常用谷氨酸产生菌如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等，诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。生产L-亮氨酸的日本企业占主导地位，尤以日本味之素公司，其在亮氨酸产量和品质均具有明显优势。

如何提高L-亮氨酸产量、生产强度等，是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明得到了一株L-亮氨酸高产菌株并利用其发酵法生产L-亮氨酸。

本发明提供一种高效发酵法生产L-亮氨酸的方法，所述方法是将L-亮氨酸生产菌的种子液按8～12％的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30～35℃，控制pH为6.8～7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600～700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养56～60h。

所述发酵使用的发酵培养基，每L中含有：葡萄糖130～160g、玉米粉30g、(NH₄)₂SO₄6.5g、MgSO₄·7H₂O2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素100μg、维生素B₁300μg、FeSO₄0.02g、ZnSO₄0.01gMnSO₄0.01g，NaOH调节pH至7.2。

所述种子液使用的种子培养条件为：取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30～35℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14～18h。

所述L-亮氨酸生产菌为黄色短杆菌。

所述L-亮氨酸生产菌为具有遗传标记的L-亮氨酸生产菌株FMME289，其遗传标记为蛋氨酸缺(Met^r)、异亮氨酸缺陷(Ile^L)、磺胺胍(SG^r)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TA^r)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HL^r)。

本发明的有益效果：

本发明以生产谷氨酸的黄色短杆菌G14(CICC编号20160)为出发菌株，提供了一种通过多重诱变筛选得到具有遗传标记(Met^-+Ile^L+SG^r+2-TA^r+β-HL^r)的高产L-亮氨酸的黄色短杆菌FMME289，该菌株生产稳定，重复性良好。

附图说明

图1：黄色短杆菌G14诱变图谱；

图2：HPLC检测亮氨酸标准样品；

图3：HPLC检测发酵液中亮氨酸。

具体实施方式

诱变处理和筛选过程中所用的各种培养基的组成：斜面和种子培养基：葡萄糖2g、酵母粉5g、胰蛋白胨10g、CaCl₂5g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，自然pH。

完全培养基：葡萄糖10g、酵母粉5g、胰蛋白胨10g、CaCl₂5g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，pH自然。