[发明专利]双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种食品中双歧杆菌的实时荧光 PCR检测方法。

背景技术

双歧杆菌是一类存在于人体中非常重要的益生菌群，是人体健康的重要指标之 一，于1899年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离出来的专性厌氧菌。研 究证实双歧杆菌具有平衡肠道菌群、降胆固醇、延缓衰老及抗肿瘤等生理功能。目前， 有关双歧杆菌的微生态制剂的研究已成为一大热点，并广泛应用于食品、保健和医疗 等领域。

GB4789.34-2012食品安全国家标准规定了双歧杆菌的检验鉴定标准，该标准利 用传统培养基进行细菌形态和生化鉴定，并结合气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代 谢产物，但此方法耗时耗力，难以在实际检测中推广，不能充分满足对含有双歧杆菌 食品中双歧杆菌溯源和符合性的执法检验和整治监管的需要。因此有必要建立一种准 确客观的检测双歧杆菌的新方法。

发明内容

本发明首要目的在于提供一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技 术所存在的上述缺点和不足。本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，以及检 测试剂盒的应用。本发明的第三个目的在于提供一种双歧杆菌的实时荧光PCR的引物 对和探针。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，该方法包括 以下步骤：

步骤一：以双歧杆菌标准菌株的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR 扩增产物；

步骤二：检测扩增产物的荧光信号；

其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增双歧杆菌的特异性引物对和双歧杆菌 的特异性探针，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQID NO.2所示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。

根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：

反应体系为：2XHRqPCRMasterMix12.5μL，引物各1.25μL，探针0.625 μL，ddH₂O7.375μL，DNA模板2μL；

反应的条件为：95℃，5min；95℃，10s58℃，45s，45个循环。

作为本发明的第二个方面，一种双歧杆菌的检测试剂盒，含有以下试剂：

(a)扩增双歧杆菌的特异性引物对；

(b)双歧杆菌的特异性探针；

其中，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2 所示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。

根据本发明，所述检测试剂盒还包括：

(c)标准参照物。

本发明的检测试剂盒可用于检测食品中添加的双歧杆菌。

作为本发明的第三个方面，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQID NO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。

本发明的有益效果是：

1、可快速、简便地检测食品中是否存在双歧杆菌；

2、其特异性好，且灵敏度高，特别适用于各类益生菌发酵乳、婴幼儿配方奶粉 等食品中是否按标识添加双歧杆菌的检测。

附图说明

图1为实时荧光PCR引物特异性试验扩增曲线图。

图2为实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。

图3为实时荧光PCR检出限试验扩增曲线图。

图4(A)和图4(B)为25个标示含双歧杆菌食品的实时荧光PCR扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明 本发明而非用于限定本发明的范围。本发明的实验材料和仪器如下：

(1)标签标识含有双歧杆菌酸奶、发酵乳、婴幼儿配方奶粉和食品均为市售产 品。