[发明专利]检测BRCA1基因表达的引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.检测BRCA1基因表达的引物和探针，其特征在于，

BRCA1基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，

BRCA1基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，

BRCA1基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的检测BRCA1基因表达的引物和探针，其特征在于，BRCA1Taqman荧光探针核苷酸序列5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB。

3.一种检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的检测BRCA1基因表达的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测内参基因B2M表达的引物和探针：

B2M基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，

B2M基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，

B2M基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。

5.根据权利要求4所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括第一链cDNA合成试剂，荧光定量PCR检测反应液，阳性对照品及阴性对照品；其中阳性对照品为梯度浓度的BRCA1基因标准品和梯度浓度的B2M基因标准品，阴性对照为DEPC水。

6.根据权利要求5所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，所述第一链cDNA合成试剂包括：反转录酶1～5U、反转录10×RTBuffer适量、dNTPs1～2mM、BRCA1基因反转录引物对1～10pM、内参基因B2M反转录引物对1～10pM，DEPC水适量。

7.根据权利要求5所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测反应液包括：Premix、BRCA1基因上下游引物对1～10pM、BRCA1基因Taqman荧光探针1～10pM、B2M基因上下游引物对1～10pM、B2M基因Taqman荧光探针1～10pM、DEPC水适量；所述Premix包括DNA聚合酶1～2U、2.0～5.0mMMgCl₂、0.2～0.8mMdNTPs、10×Buffer和RNaseH。

8.权利要求5～7任一所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：

(1)以乳腺癌组织和癌旁正常组织为待检样品，提取待检样品中的RNA，反转录成样品cDNA；

(2)荧光定量PCR：以样品cDNA作为模板，用检测BRCA1基因表达的引物和探针、检测内参基因B2M表达的引物和探针进行荧光定量PCR反应；BRCA1基因标准品与B2M基因标准品及阴性对照品也与样品cDNA同时上机进行相同的操作；同一PCR反应绘制两种标准品的标准曲线；

(3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，分析标准曲线的R²在0.99以上，BRCA1基因和B2M基因扩增效率应在94～100％范围，再根据荧光定量PCR仪器给出的Ct值，按照以下公式进行计算：

△Ct(乳腺癌组织)＝Ct(乳腺癌组织BRCA1基因)-Ct(乳腺癌组织B2M基因)；

△Ct(癌旁正常组织)＝Ct(癌旁正常组织BRCA1基因)-Ct(癌旁正常组织B2M基因)；

△△Ct＝△Ct(乳腺癌组织)-△Ct(癌旁正常组织)

相对表达率＝2^-△△Ct；相对表达率＞1判断为乳腺癌BRCA1基因高表达；相对表达率≤1判断为乳腺癌BRCA1基因低表达。

9.根据权利要求8所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中反转录程序为：50℃，30min；95℃，5min；5℃，5min1个循环。

10.根据权利要求8所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)中荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃30s40个循环，当荧光基团选择FAM时在60℃30s时采集荧光信号。