[发明专利]检测BRCA1基因表达的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，特别是涉及一种用荧光定量PCR方法快速高效地检测人类BRCA1基因mRNA表达水平的引物、探针及试剂盒。

背景技术

乳腺癌是全球第二大常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中居首位。且发生率呈直线上升趋势。5～10％的乳腺癌是因为携带高外显率的乳腺癌易感基因突变所致。其中最常见的易感基因是BRCA1基因。

BRCA1(breastcancelsusceptibilitygene1)基因定位于17q21，约81kb，含有23个外显子。BRCA1作为一种抑癌基因，呈常染色体显性遗传，其表达的蛋白含1863个氨基酸，具有重要的生物学活性，参与细胞周期调控、DNA损伤修复、基因的转录调节，细胞凋亡和泛素化等，当BRCA1基因的表达出现问题时，会导致DNA修复功能障碍、细胞代谢和增殖，最终导致肿瘤的发生。

新辅助化疗是重要的乳腺癌综合治疗手段之一，其中铂类化合物和微管类化疗药以其抗癌谱广、作用强等特点成为最常使用的肿瘤化疗药物。然而铂类化合物和微管类化疗药的疗效存在显著的个体差异。这种差异与乳腺癌组织中BRCA1基因mRNA表达水平密切相关，在乳腺癌细胞株中BRCA1mRNA的表达水平低可增加对铂类药物的敏感性，但对微管药物耐药；而BRCA1的过表达则使损伤的DNA迅速修复，导致瘤细胞对铂类药物耐药，同时却对微管类化疗药敏感。因此研究BRCA1基因的表达水平对铂类化疗药物及抗微管类药物的指导用药具有重大的临床意义。

用于检测BRCA1表达的方法包括蛋白水平的免疫组化和荧光定量PCR法等。其中免疫组化法实验过程较为繁琐，需要的试剂种类繁多，周期长，试验结果主观性高；荧光定量PCR中SYBRGreenⅠ法特异性差，而双探针杂交法成本价格较高。上述现有技术的缺陷均限制了BRCA1表达检测的适用范围。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明采用实时荧光定量PCR技术结合Taqman探针法用于检测BRCA1基因的表达水平。具体地，本发明提供了检测BRCA1基因表达的引物和探针，包括该探针的检测试剂盒，还提供了该检测试剂盒的使用方法。

本发明提供的检测BRCA1基因表达的引物和探针，包括：

BRCA1基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，

BRCA1基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，

BRCA1基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

优选地，上述检测BRCA1基因表达的引物和探针，BRCA1Taqman荧光探针核苷酸序列5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB。

本发明提供的一种检测BRCA1基因表达的试剂盒，包括以上任一所述的检测BRCA1基因表达的引物和探针。

优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，还包括用于检测内参基因B2M表达的引物和探针：

B2M基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，

B2M基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，

B2M基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。当然地，该Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

选择内参基因是为了校正实验中出现的误差，确保实验结果的正确性。通过实验验证以及软件GeNorm和NormFinder分析发现，B2M较GAPDH及GUSB等为内参的肿瘤和正常组内及组间的表达差异最小。

优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，还包括第一链cDNA合成试剂，荧光定量PCR检测反应液，阳性对照品及阴性对照品；其中阳性对照品为BRCA1基因标准品和B2M基因标准品，阴性对照为DEPC水。其中，BRCA1标准品可以为含有梯度浓度BRCA1基因组质粒DNA的溶液，B2M标准品可以为含有梯度浓度B2M基因组质粒DNA的溶液。

优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，所述第一链cDNA合成试剂包括：反转录酶1～5U、反转录10×RTBuffer适量、dNTPs1～2mM、BRCA1基因反转录引物对1～10pM、内参基因B2M反转录引物对1～10pM，DEPC水适量。