[发明专利]SIMM法快速定位突变性状相关基因

权利要求书

1.一种鉴定突变体中性状相关基因的方法，其特征在于所述方法，包括以下步骤：

a）将确定为单基因调控的突变体与野生型材料进行杂交，获得杂合F₁植株后自交，得到F₂群体;

b）挑选F2中具有突变表型的纯合植株，混样提取DNA，进行高通量测序；

c）对原始测序数据进行质检并过滤，通过比较分析，寻找突变体特异的SNP位点；

d）根据突变体中的SNP评价参数在染色体上的分布情况，获得候选功能基因区域；

e）对候选区域内基因进行筛选，获得候选SNP位点。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤d）后还进一步包括以下步骤：

a）对在候选区域内无候选SNP位点的突变体，将比对到候选区域内的短序列（reads）与未能比对上的reads进行聚类，通过比较分析，获得突变体特异SNP位点；

b）对无明显候选区域的突变体，将过滤后的测序reads进行聚类，通过比较分析，获得突变体特异SNP位点；

c）对无参考基因组物种，分析方法同步骤b；

d）对候选SNP位点，提取该位点前后序列设计引物，并采用HRM法进行连锁分析，确定突变性状相关SNP位点。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤a）中的F₂群体要求具有突变体表型的植株大于30株。

4.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤b）中的具有突变表型的纯合植株，是指如为隐性基因控制突变体，则挑选突变表型植株即可；如为显性基因控制突变体，则需挑选对应F₃代中无表型分离的植株。

5.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤b）中的混样提取DNA，要求用于混样提取DNA的植株至少有20株，DNA浓度和总量需达到IlluminaHiseq2000或2500测序平台建库标准。

6.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤c）中的对原始测序数据进行质检并过滤，是指要求测序reads平均质量不能低于20，即PhredQ>=20，同时N所占比例不得大于10%，最终过滤后数据达到覆盖整个基因组20X以上。

7.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤c）中的比较分析，要求采用比对软件将过滤后的数据比对到参考基因组上，并通过筛选其他突变体中Alleleindex>=0.8，获得定位突变体特异SNP位点。

8.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤d）中的根据突变体中的SNP评价参数在染色体上的分布情况，要求根据突变位点SNPindex及ED值在染色体的分布情况，获得候选功能基因区域。

9.权利要求1所述的方法，其中所述的步骤e）中的对候选区域内基因进行筛选，要求根据候选区域内突变位点SNPindex及ED值，以及是否造成氨基酸变化，或影响mRNA的剪切来筛选获得候选突变性状相关位点。

10.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤a）中的reads进行聚类，要求对候选区域附近及未比对上reads进行聚类，挑选出定位突变体特有，且在至少80%的其他突变体中有同源序列的reads。

11.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤a）、b）和c）中的SNP位点，要求突变体特有的reads与其他突变体同源reads间的SNP位点，在单条reads上不得多于3个，且不得出现在reads两端5bp内。

12.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤b）和c）中的reads进行聚类，通过比较分析，要求对过滤后的所有reads进行聚类，挑选出定位突变体特有，且在至少80%的其他突变体中有同源序列的reads。

13.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤a），b）和c）中的reads进行聚类，通过比较分析，要求候选reads覆盖深度>=5，且不高于平均测序深度的10倍。

14.权利要求2所述的方法，其中所述的步骤d）中的确定突变性状相关SNP位点，要求对候选SNP位点附近reads进行聚类，并根据该位点前后序列设计引物，用于HRM验证。