[发明专利]SIMM法快速定位突变性状相关基因

说明书

技术领域

本发明属于生物信息学与功能基因组学领域，具体涉及一种利用SIMM法快速定位突变性状相关基因的方法和应用。

技术背景

突变体是功能基因组学研究的重要材料，近年来，利用水稻突变体进行水稻功能基因组学研究取得了重大进展。分离克隆相关基因是研究利用突变体的前提和基础，目前水稻突变体基因克隆最常用的技术有图位克隆(map-basedcloning)，转座子标签(transposontagging)和T-DNA插入标签(T-DNAtagging)技术等。然而，传统的图位克隆需利用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在此基础上逐渐缩小候选区间而定位目的基因，该过程较繁琐，耗时长，成本高。而利用转座子标签技术依赖于转座子在植物中的转座频率和活性，且需要筛选大量的个体来鉴定突变个体，多拷贝的基因还会限制其应用，因此该技术的应用范围有限。

在水稻等农作物的育种过程中，利用不同的材料构建群体进行性状相关基因的定位已经有许多相关报道。随着水稻基因组测序的完成以及二代测序技术的日趋成熟，一些基于二代测序技术定位性状相关基因的方法逐渐被提出，大大缩短了克隆性状相关基因的周期，降低了实验成本，并在推广的过程中不断地改良。SHOREmap是一种在植物正向遗传学中应用较好的定位突变的方法。它需要将突变体和与其遗传背景差异较大的品种进行杂交产生后代群体，从而定位突变位点所在区域，定位区间的大小往往取决于定位群体的大小，并会受到遗传背景的影响而使得精确定位比较困难。在此基础上，其他研究小组提出了相似和改进的方法，并成功在拟南芥中定位到与突变性状相关的位点(Schneeberger,K.etal.SHOREmap:simultaneousmappingandmutationidentificationbydeepsequencing.NatMethods6,550-1(2009))。

选取合适的杂交品种是这些方法能否准确定位突变位点所在区域成功的关键。通过重测序水稻F2群体中突变体池和野生型亲本，Abe等提出了MutMap等一系列方法,该方法综合运用全基因组学、生物信息学、分子遗传学和分子生物学等多学科交叉研究方法，结合高通量的二代测序方法，充分利用水稻重测序的数据及分析优势，把突变体群体测序结果与野生型基因组序列相比对，找出造成水稻突变体性状的基因，成功定位与水稻矮杆，叶色，抗稻瘟病等相关的基因(Abe,A.etal.GenomesequencingrevealsagronomicallyimportantlociinriceusingMutMap.NatBiotechnol30,174-8(2012))。MutMap大大降低了基因克隆成本，缩短了基因克隆时间。对于无法通过杂交构建群体的突变体，MutMap+通过直接比较M3群体中突变体与野生型的基因型，鉴定与突变性状相关的突变位点(Fekih,R.etal.MutMap+:geneticmappingandmutantidentificationwithoutcrossinginrice.PLoSOne8,e68529(2013))。由于水稻不同品种之间的多样性，在定位突变性状相关基因时，材料与常用的水稻参考基因组之间可能存在大量的多态性位点或区域，甚至大片段的插入或缺失，导致在参考基因组上无法准确定位突变性状相关基因，因此，为了鉴定位于参考基因组上缺失区域的突变基因，基于MutMap方法和从头组装的方法，提出MutMap-gap方法并成功应用于克隆水稻抗稻瘟病基因Pii(Takagi,H.etal.MutMap-Gap:whole-genomeresequencingofmutantF2progenybulkcombinedwithdenovoassemblyofgapregionsidentifiesthericeblastresistancegenePii.NewPhytol200,276-83(2013))。此外，对于定位与数量性状相关的区域，即QTL定位，QTL-seq采用二代测序的方法，分别测序F2群体中极端数量性状表型的个体，通过比较极端个体间的差异，得到候选区间(Takagi,H.etal.QTL-seq:rapidmappingofquantitativetraitlociinricebywholegenomeresequencingofDNAfromtwobulkedpopulations.PlantJ74,174-83(2013))。