[发明专利]一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法

权利要求书

1.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，其特征在于，包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因；

牛KDM4B的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；牛KDM4C基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白的TetR的载体；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框；

在牛KDM4B或KDM4C基因末端添加Kozak序列、EGFP标签和酶切位点。

2.如权利要求1所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，其特征在于，所述的阻遏物表达载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接。

3.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，其特征在于，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体共转染到宿主细胞；通过与阻遏物相对应的诱导表达药物对转染的细胞诱导表达，筛选表达载体阳性表达的细胞作为核供体细胞；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白TetR的载体；所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

4.如权利要求3所述的基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，其特征在于，所述的转染为电击转染；

将阻遏物表达载体pCMV-Tet3G和含有阻遏操纵子的表达载体和pTRE3G-EGFP-KDM4B/C按4:1的质量比电击共转染；

所述的pTRE3G-EGFP-KDM4B/C是在pTRE3G-BI载体多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接；

所述的诱导表达药物为Dox，其浓度为100～200ng/mL；

所述的表达载体阳性表达的细胞激发后发出绿色荧光。

5.一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的融合方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别构建携有荧光标签的牛KDM4B基因或KDM4C基因的真核诱导表达载体，并将所构建的载体与可诱导表达的载体通过电击共转化胎牛原代成纤维细胞，筛选出细胞克隆，加入诱导表达药物对牛KDM4B基因或KDM4C基因进行诱导表达，挑取可被荧光激发的阳性细胞克隆作为体细胞核移植的牛供体细胞；

2)将所制备的牛供体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选电融合的融合细胞进行以下激活处理：2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4～10min，然后转移到1～2mmol/L 6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4～10h；

所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，并包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

3)在进行激活处理后转移到G1.5培养液中培养，并在细胞融合后第36h～60h内添加诱导表达药物，以诱导牛KDM4B基因或KDM4C基因表达；最后转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养至第7d。