[发明专利]一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法

说明书

本发明公开了一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法。本发明提供的载体包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。将阳性转染的细胞作为供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚培养至36h时，诱导表达牛KDM4B和KDM4C。本发明可以有效减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，从而显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎，胚胎移植后克隆牛的出生率也显著提高。

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法。

背景技术

体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆，疾病模型，人类器官移植，动物转基因研究，濒临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白甲基化和DNA甲基化两方面。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法，在牛体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合之后，对融合后的细胞进行处理，诱导牛KDM4B和KDM4C蛋白的表达，提高牛体细胞克隆囊胚质量和发育率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体，包括阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体，在转染时将两者共转染到供体细胞中；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体中插入有牛KDM4B或牛KDM4C基因。

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白的TetR的载体；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

还在牛KDM4B或KDM4C基因末端添加Kozak序列、EGFP标签和酶切位点；

其中，牛KDM4B的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

牛KDM4C基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的阻遏物表达载体为pCMV-Tet3G，其能够表达四环素阻遏蛋白TetR；

所述的含有阻遏操纵子的表达载体为pTRE3G-EGFP-KDM4B/C，其含有四环素操纵基因TetO，并在其多克隆位点中克隆2个拷贝的KDM4B或KDM4C，2个拷贝均连有Kozak序列，其中的1个拷贝还与EGFP标签相连接。

一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的细胞，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将阻遏物表达载体和含有阻遏操纵子的表达载体共转染到宿主细胞；通过与阻遏物相对应的诱导表达药物对转染的细胞诱导表达，筛选表达载体阳性表达的细胞作为核供体细胞；

所述的阻遏物表达载体为能够表达四环素阻遏蛋白TetR的载体；所述的含有阻遏操纵子的表达载体为含有四环素操纵基因TetO的载体，其中插入携有荧光标记的牛KDM4B或KDM4C基因的读码框。

所述的转染为电击转染；

将阻遏物表达载体pCMV-Tet3G和含有阻遏操纵子的表达载体和pTRE3G-EGFP-KDM4B/C按4:1的质量比电击共转染；