[发明专利]一种用于检测痰液中细菌的探针、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于检测痰液中细菌的探针，其特征在于：所述探针为分子信标探针，该分子信 标探针由茎环结构两部分组成，总长度25~50个碱基，其中中间的环序列部分与细菌中核糖 体RNA（16srRNA、23srRNA等）序列相匹配，两端茎序列部分为5~10个碱基互补的DNA序列， 分子信标探针的5'-端用荧光基团标记，3'-端用荧光淬灭基团标记，在常温、游离状态下分 子信标探针可自动退火形成发夹结构，荧光基团与荧光淬灭基团由于距离较近而不发出荧 光信号，只有当分子信标探针中环序列部分与靶序列特异性结合之后，荧光基团与荧光淬 灭基团彼此分离，进而发出荧光信号；所述探针是通过核酸杂交的原理检测痰液中的细菌。

2.根据权利要求1所述的用于检测痰液中细菌的探针，其特征在于，所述探针5'-端的 荧光基团为FAM、JOE、HEX、VIC、ROX、CY3、CY5中的一种，所述探针3'-端的荧光基团为 DABCYL、TAMRA、BHQ中的一种。

3.一种用于检测痰液中细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）权利要求1或2中所述的探针；

（2）液化液；

（3）裂解液；

（4）终止液；

（5）固定液。

4.根据权利要求3所述的用于检测痰液中细菌的试剂盒，其特征在于，所述液化液包 括：1%(w/v)PEG，0.6mMDTT，13.4mMNaCl，0.3mMKCl，1mMNaH₂PO₄，0.1mMKH₂PO₄，50 mMEDTA，0.1%(v/v)TritonX-100，50mMTris·HClpH8.0；

所述裂解液包括：5M盐酸胍，0.2mMDTT，50mMEDTA，0.5%(w/v)过硫酸铵，0.1%(v/ v)TritonX-100，10mMTris·HClpH7.0；

所述终止液包括50mMTris·HClpH10.0，0.5MNaCl，0.1%(v/v)NP-40，0.5%(v/v) TritonX-100；

所述固定液包括：5%(w/v)甘油，0.2mMDTT，25mMNaCl，0.3mMKCl，0.6mM NaH₂PO₄，0.6mMKH₂PO₄，50mMEDTA，10mMTris·HClpH7.0。

5.一种采用如权利要求3、4任一所述试剂盒的用于检测痰液样本中细菌的方法，其特 征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)取待检痰液样本，加入到液化液中，震荡混匀；

(b)取按步骤(a)操作获得的液体3~20ul滴至载玻片上，45~65℃烘干3~20min；

(c)将按步骤(b)操作获得的载玻片浸入乙醇中3~20min，45~65℃烘干3~20min；

(d)在按步骤(c)操作获得的载玻片加样孔中加入探针3~20ul，置于加热板中45~65℃ 避光烘干3~20min；

(e)将按步骤(d)操作获得的载玻片浸入终止液中1~60sec，置于加热板中45~65℃烘 干3~20min；

(f)在按步骤(e)操作获得的载玻片加样孔中加入固定液3~20ul，加盖盖玻片，用荧光 显微镜镜检观察，用10×物镜观察计数，用40×或100×物镜观察细菌形态。