[发明专利]一种用于检测痰液中细菌的探针、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测用的探针，具体涉及一种用于检测痰液样本中细菌的探针、 试剂盒和方法。

背景技术

细菌培养和涂片检查是应用最为广泛的病原学诊断技术之一，其中痰液培养约占 50%以上。痰液标本检验对于呼吸道疾病的诊断和鉴别具有重要的临床意义。正常人下呼吸 道是无菌的，当人体的肺部或支气管发生细菌性感染时，痰液分泌量会明显增加。经痰液细 菌培养，分离出病原菌，有助于对下呼吸道感染性疾病的诊断和治疗。经痰液培养发现常见 的致病菌：

革兰阳性菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、放线菌、奴卡菌、厌氧球菌、 白喉棒状杆菌等；

革兰阴性菌：卡他布兰汉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌、假 单胞菌、军团菌等。

在我国的相关卫生标准中，测定细菌数量的方法，是在严格规定的培养方法和培 养条件下进行的，使得适应这些条件的每一个活菌细胞能够生成一个肉眼可见的菌落，所 生成的菌落总数即为检测的细菌总数。

传统习惯程序的痰液标本细菌学检验其临床符合率并不高，其原因是多方面的。 除了痰标本采集不规范导致的不合格标本带来的培养结果与病人感染不相符外，还因为微 生物和人体的相关性本身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌 可能为正常携带，而细菌在肺通气功能异常病人的下呼吸道的可以发生单纯定植或感染， 要证明培养结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得一直以来在对于 痰培养的标准化进展十分缓慢。

痰液细菌培养阳性率普遍较低，临床符合率差的关键因素是痰标本采集不规范， 不合格痰标本将直接导致病原菌被分离的机会降低，大量正常菌群也会抑制病原菌的生长 或干扰病原菌的检出，降低了临床符合率；再有就是操作程序的不规范，不重视直接涂片， 检验过程控制的不严密；且痰液中细菌的种类很多，它们的生理特性和所需要的培养条件 不尽相同。如果要采用培养的方法检测细菌种类和数量，必须采用不同的培养基及培养条 件，其工作量很大，以上均为导致临床符合率低的重要原因。

因此，在当前痰液细菌检测方法不能满足痰液细菌样本简便、快速检测要求的条 件下，一种仪器应用广泛廉价、操作简便、结果判定直观、灵敏度高的检测方法呼之欲出。

荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization,FISH）是一种分子细胞 遗传学技术，是20世纪80年代末期发展起来的一种非放射性原位杂交技术。FISH的基本原 理是用荧光标记的单链核酸为探针，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成 可被检测的杂交双链核酸。可用荧光标记的探针直接与染色体进行杂交从而对基因进行染 色体定位。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体结构变异分析、病 毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

分子信标（molecularbeacon）是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新 型核酸荧光探针，其与靶序列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号，因其检测具有高 灵敏性、高特异性，且可用于活体实时检测，因而被广泛应用于生物学等诸多领域。

在病原菌遗传信息中，以16SrRNA基因为代表的核糖体RNA基因是病原菌上编码 核糖体RNA（rRNA）相对应的DNA序列，存在于所有病原菌的基因组中。该基因具有高度的保 守性和特异性以，对以16SrRNA基因为代表的核糖体RNA检测技术已成为病原菌检测和鉴 定的一种强有力工具。

本发明有效拟合了荧光原位杂交技术、分子信标技术、荧光显微镜技术的优点，对 痰液样本中的细菌进行直接、简便、有效的检测。

发明内容

发明的目的在于：提供一种高效、快速地检测痰液样本中细菌的探针、方法和试剂 盒。