[发明专利]基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白及体外构建方法和应用

权利要求书

1.基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，为CTB5/EGFP-CTA2-TAT，为CTB5以 及EGFP-CTA2-TAT嵌合组装而成。

2.根据权利要求1所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，CTB5的氨基 酸序列为SEQIDNO：1所示。

3.根据权利要求1所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，EGFP-CTA2- TAT的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。

4.权利要求1～3所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特征 在于，其步骤如下：

S1、基因克隆与表达

采用BamHI/HindIII双酶切的方法，将编码CTB的基因克隆到双基因表达载体petduet- 1的多克隆位点1的位置，构建的载体命名为petduet-CTB；

将编码有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表达载体pet22b(+)中，并去除其信号肽，克隆时 选用的酶切位点为NdeI和XhoI，构建的载体命名为pet22b-EGFP-CTA2-TAT；

S2、EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化

质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌，即大肠杆菌BL21(DE3)中，并实现表达； pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大肠杆菌BL21(DE3)系统中以可溶性形式表达，最终经由Ni-NTA 纯化得到电泳级纯的产品。

S3、霍乱毒素B亚单位包涵体蛋白纯化及复性

质粒petduet-CTB导入宿主菌BL21(DE3)中，并实现表达，表达产物为包涵体，包涵体通 过洗涤，去除表面杂质后，重新溶于梯度浓度的尿素中，通过电泳筛选纯的CTB单体，CTB单 体经梯度透析复性形成稳定的CTB5；

S4、体外组装AB5结构嵌合蛋白

纯化的CTB5与EGFP-CTA2-TAT通过超滤除去大部分的盐离子后，按CTB5:EGFP-CTA2- TAT的质量比为5：1至8：1的比例投入反应容器中，通过加入柠檬酸使混合物的pH值为2.3- 3.0之间20s后迅速加入EDTA二钠调节PH至8.5.室温静置至少1小时，直至荧光逐渐恢复，即 可。

5.根据权利要求4所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，设计引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用 于从pet28a-CTB中扩增目标基因序列CTB即编码CTB的基因。

6.根据权利要求4所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，设计引物如下：CGGAATTCCATATGGTGAGCAAGG和CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于从合 成的基因序列中扩增具有酶切位点NdeI/XhoI的基因序列EGFP-CTA2-TAT，即编码有EGFP- CTA-TAT的基因。

7.根据权利要求5所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，保留载体petduet-CTB上原有的组氨酸标签。

8.根据权利要求6所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，保留载体pet22b-EGFP-CTA2-TAT上原有的组氨酸标签。

9.根据权利要求8所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特 征在于，EGFP-CTA2-TAT的基因序列之间用连接肽作了相应的修饰。

10.基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白用于肿瘤的治疗。