[发明专利]基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白及体外构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白及其 体外构建方法和应用。

背景技术

构建一种载体来协助诸如大蛋白质类药物高效、低毒、无创伤地穿过血脑屏障来 治疗中枢神经系统病症是目前研究的热点。人体免疫缺陷病毒HIV反式激活因子TAT，是一 种富含大量阳离子的短肽，目前研究表明，TAT与目标蛋白基因融合后形成的融合蛋白，能 够高效、快速、低剂量、无创伤地进入细胞，目前研究表明，但TAT的融合蛋白能在100ug/ml 的剂量下能于1小时内进入细胞，并且在细胞内的蛋白分布率达70％以上。因此，TAT融合蛋 白显著改善目标蛋白跨膜能力已经毋庸置疑。天然的霍乱毒素(CT)分子由两个部分组成(A 和B)，B作为载体的作用，天然的结构为五聚体，其五聚体能与鼻腔内的神经节苷脂GM1结合 而并不进入细胞。A亚单位利用B亚单位五聚体中间的小孔，进入细胞，并于细胞体内水解成 A1和A2部分，A1和细胞内辅酶作用，干扰细胞信号，使细胞内大量盐离子外输，进而导致机 体缺水，引起腹泄甚至死亡。研究表明，与B亚基作用形成天然霍乱毒素的为A2部分，A2与B 之间通过亲疏水性的作用，紧密排列在一起，进而引导A1部分进入细胞，并致病。结合CT的 分子结构，用EGFP替换A1部分，并加以TAT修饰，使EGFP通过B亚单位进入细胞后，能够继续 穿膜，直接穿过血脑屏障，最终，构建获得一种嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT.为了解决这 一难题。

目前有专利报道通过将CTB和EGFP-CTA2-TAT共转化到同一宿主菌里，通过双抗性 筛选嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT。然而，事实是CTB具有五对二硫键，非常容易形成包涵 体，上清中无法通过WESTERNBLOT和ELISA的方法检测出CTB的五聚体单位。并且在操作过 程中发现，CTB的包涵体的过表达，还会影响EGFP-CTA2-TAT蛋白上清的表达量，双质粒共转 化会造成宿舍菌内部负荷过重，导致细菌难长、不表达外源蛋白甚至直接死亡。形成嵌合蛋 白CTB5/EGFP-CTA2-TAT，并使其保持荧光，穿膜活性，更是难上加难。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种获得一种新型的嵌合蛋白，并高度保持其生物活 性。该嵌合蛋白能与鼻腔处的神经结苷脂受体结合，通过滴鼻给药的方式，将蛋白EGFP- CTA2-TAT以无创的方式经由鼻腔处进入体内。在生物体内，TAT与CTA2的KDEL序列协同作 作，大大提高EGFP穿膜的能力，使EGFP能够顺利穿过血脑屏障，并定位于脑部，以达到高效 治疗脑部等神经中枢性疾病。当载体上的EGFP(约26kd)替换为大小与之相类似的药物蛋 白，即发挥了本载体递药的作用，该载体未来很有可能成为脑部疾病患者的良药。

本发明通过以下技术方案来实现：

基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，为CTB5/EGFP-CTA2-TAT，为CTB5以及EGFP- CTA2-TAT嵌合组装而成。

其中，CTB5的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。

EGFP-CTA2-TAT的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。

基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其步骤如下：

S1、基因克隆与表达

采用BamHI/HindIII双酶切的方法，将编码CTB的基因克隆到双基因表达载体 petduet-1的多克隆位点1的位置，构建的载体命名为petduet-CTB；

将编码有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表达载体pet22b(+)中，并去除其信号肽，克 隆时选用的酶切位点为NdeI和XhoI，构建的载体命名为pet22b-EGFP-CTA2-TAT；

S2、EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化

质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌，即大肠杆菌BL21(DE3)中，并实现表达； pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大肠杆菌BL21(DE3)系统中以可溶性形式表达，最终经由Ni-NTA 纯化得到电泳纯的产品；

S3、霍乱毒素B亚单位包涵体蛋白纯化及复性