[发明专利]一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法

权利要求书

1.一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：以天然GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白结合的GDP，作为荧光共振能量转移的供体；构建Rab蛋白的效应因子与绿色荧光蛋白GFP融合表达的载体，融合蛋白经过表达纯化作为荧光共振能量转移的受体，而后在体外根据荧光共振能量转移方法直接检测以mantGTP形式结合的Rab蛋白和与绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的相互作用；

具体为

1)构建绿色荧光蛋白(GFP)与载体融合表达，得带有GFP的融合表达载体；

2)扩增效应因子，并将扩增效应因子连接到上述带有GFP标签的融合表达载体上，形成效应因子与GFP的重组载体；

3)将效应因子与GFP的重组载体与Rab蛋白分别进行表达和纯化；而后利用GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白紧密结合的GDP；

4)基于荧光共振能量转移检测Rab蛋白与效应因子之间的相互作用。

2.按权利要求1基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤1)以pCAMBIA1302质粒为模板，GFP_forward和GFP_reverse为引物扩增绿色荧光蛋白GFP的基因，而后利用载体上位于BamHI之前的任意限制性内切酶识别位点以及BamHI对扩增产物绿色荧光蛋白GFP的基因和载体分别进行双酶切，而后将GFP基因和载体的酶切片段进行连接，得带有绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体。

3.按权利要求2基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述引物为：

GFP_forward-CCATGGGCCATCATCATCATCATCACGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAAG；

4.按权利要求1基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤2)通过PCR的方法扩增效应因子的基因，而后利用带有GFP的融合表达载体的多克隆位点中BamHI以BamHI之后的任意两个限制性内切酶进行双酶切，把效应因子的片段克隆到带有GFP的融合表达载体，即得效应因子与GFP的重组载体。

5.按权利要求4基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述效应因子与GFP的重组载体中效应因子与绿色荧光蛋白GFP之间带有BamHI限制性内切酶位点。

6.按权利要求1基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤3)中置换是利用GTP的荧光类似物mantGTP(2’-/3’-O-(N-Methylanthraniloyl)guanosine-5’-O-triphosphate)置换与Rab蛋白结合的GDP。

7.按权利要求1基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，其特征在于：所述荧光共振能量转移方法中荧光信号检测所用荧光分光光度计的设定参数为：激发波长为365nm，发射波长为380-600nm，入射狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，光电倍增管电压为700V。