[发明专利]一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法

说明书

本发明属于生物科学技术领域，具体的说是基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法。通过天然GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白结合的GDP，作为荧光共振能量转移的供体；构建Rab蛋白的效应因子与绿色荧光蛋白GFP融合表达的载体，融合蛋白经过表达纯化之后作为荧光共振能量转移的受体；可以利用荧光光谱仪基于荧光共振能量转移的方法在体外直接检测以mantGTP形式结合的Rab蛋白和与绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的相互作用。本发明提供了一种灵敏快捷的检测Rab蛋白与其效应因子相互作用的新方法，完善了蛋白质相互作用的体系。

技术领域

本发明属于生物科学技术领域，具体的说是一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法。

背景技术

Rab蛋白是小分子GTP结合家族中最大的亚家族，是一种单体形式的GTP结合蛋白。它在GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式之间循环，不同形式的Rab蛋白在结构上会发生变化，这个构象发生变化的区域叫做分子开关区域，包括分子开关I(Switch I)和分子开关II(Switch II)。分子开关I和II是Rab蛋白与其互做因子结合的关键位点。Rab蛋白在这两种核苷酸结合形式之间的转换可由其上游的调控蛋白来催化，例如鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)，它能催化Rab蛋白的GDP转化为GTP；而GTP结合形式的Rab蛋白又可以与下游的多种不同种类的效应因子相互作用，使效应因子功能化，在囊泡转运过程中发挥特定功能。

对Rab蛋白与其效应因子的相互作用的检测可以基于同位素³²P标记的鸟苷酸，通过免疫共沉淀的方法进行检测，这种方法操作步骤繁琐，并且安全性不高。此外可以利用非标记的技术，例如把重组的Rab蛋白在GTP结合形式下加入到细胞提取液中，通过免疫印记的方法检测其与效应因子的相互作用，但是这种方法操作步骤繁琐，只能做半定量的检测。近来对鸟苷酸的荧光类似物N-methyl-3′-O-anthraniloyl(MANT)的研究得到较大发展，荧光信号比较灵敏，并且由于mantGDP/mantGTP与Rab蛋白的结合或者解离可以引起荧光信号的较大变化，目前已广泛用来检测Rab蛋白与鸟苷酸交换因子(GEF)和GTP酶激活蛋白(GAP)之间的结合。但在以mantGTP为荧光发射基团来检测Rab蛋白和效应因子的相互作用的研究中，效果并不理想，因为效应因子在与Rab:mantGTP结合时，它的分子开关I和II在结构上变化并不是很大，所以通过直接荧光的方法往往检测不到他们之间的相互作用，目前经常是利用mantGTP做为荧光发射基团，采用荧光偏振的方法来检测。荧光偏振的方法是基于用垂直的偏振光去激发荧光发射基团，可以在垂直和水平的偏振平面上去检测发射光谱的强度，这种方法与被检测分子的大小有很大关系，如果效应分子很小的话，往往也得不到令人满意的结果。此外荧光偏振的方法噪声相对比较大，灵敏度低，这些都限制了Rab蛋白 与效应因子之间相互作用的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

种基于荧光共振能量转移方法检测Rab蛋白与其效应因子间相互作用的方法，以天然GTP的荧光类似物mantGTP置换与Rab蛋白结合的GDP，作为荧光共振能量转移的供体；构建Rab蛋白的效应因子与绿色荧光蛋白GFP融合表达的载体，融合蛋白经过表达纯化作为荧光共振能量转移的受体，而后在体外根据荧光共振能量转移方法直接检测以mantGTP形式结合的Rab蛋白和与绿色荧光蛋白GFP融合表达的效应因子之间的相互作用。

具体为：

1)构建绿色荧光蛋白(GFP)与载体融合表达，得带有GFP的融合表达载体；

2)扩增效应因子，并将扩增效应因子连接到上述带有GFP的融合表达载体上，形成效应因子与GFP的重组载体；