[发明专利]HER-2基因和/或TOP2A基因检测探针及其制备方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，特别是涉及HER-2(ERBB2)基因和/或TOP2A基因检测探针及 其制备方法和试剂盒。

背景技术

HER-2(ERBB2)基因在20％-30％的乳腺癌患者中有基因的扩增和蛋白的过度表 达。HER-2是目前公认的一个乳腺癌重要的预后/预测因子，在多变量分析结果中，HER-2是 肿瘤复发和总生存期长短的独立预后因素。HER-2阳性的乳腺癌浸润性强，无病生存期短， 预后差。曲妥珠单抗(赫赛汀)适用于HER-2过度表达和基因扩增的的乳腺癌。TOP2A基因调 节控制DNA的超螺旋状态，直接参与细胞过程，并且是蒽环类抗生素的靶酶，存在TOP2A基因 异常的患者预后差，无复发生存期缩短，尤其是TOP2A基因缺失的患者预后更差。基因扩增 提示肿瘤有复发的可能，或者远期的疗效下降。TOP2A基因状态在预示肿瘤化疗的反应情况 和药物治疗效果中都具有一定意义。

因此正确检测和评定乳腺癌HER-2基因和TOP2A基因状态至关重要。

HER-2基因定位于17号染色体17q12区域，HER-2的异常为扩增；TOP2A基因定位于 17号染色体17q21区域，TOP2A的异常情况分为扩增和缺失两种情况，FISH检测可对于这两 种情况作出明确判断。

荧光原位杂交(FluorescenceinsituhybridizationFISH)是20世纪80年代末 期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这 项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、 人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标 记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可 被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以 探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位 杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因 此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫 星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3) 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和 素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直接 标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。

而目前对于HER-2基因和/或TOP2A基因FISH检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种HER-2基因和/或TOP2A基因检测探针及其制备方 法，所制备的探针可用于检测HER-2基因和TOP2A基因状态，即检测HER-2基因和TOP2A基因 的指拷贝数变化，具有很好的特异性。

实现上述目的的技术方案如下。

一种HER-2基因和/或TOP2A基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取针对HER-2基因的BAC克隆为RP11-1021P11、RP11-62N23、RP11-1044P23中 至少一种，或选取BAC克隆为RP11-98J2、RP11-1065L22、CTD-2327I15中的至少一种；和/或 选取针对TOP2A基因的BAC克隆为RP11-1152A10、CTD-3217C5中至少一种，或选取BAC克隆为 RP11-737D6、CTD-3087O22、RP11-48O10、CTD-2134K5中的至少一种；

(2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；