[发明专利]一种基于酵母菌实时在线分析大气颗粒物毒性的方法

说明书

本发明公开了一种基于酵母菌实时在线分析大气颗粒物毒性的方法。首先筛选出对外界不同刺激有灵敏应激响应的酵母菌不同功能蛋白，并获得所述功能蛋白被绿色荧光蛋白标记的酵母菌；将其菌液通入微流控芯片中作为生物传感器；然后采集大气颗粒物，实时混入酵母菌的液体培养基中，通过蠕动泵通入微流控芯片中，动态观测微流控芯片中不同区域不同功能蛋白标记的活体酵母菌绿色荧光的强度变化；通过定量分析荧光的强度随时间变化数值，评估大气颗粒物的毒性。该方法集大气颗粒物采样、多通道微流控技术和单活体酵母菌传感器为一体，实现对大气颗粒物毒性的实时、原位、全组分的分析，为评价空气污染健康效应机制研究提供了在分子水平全方位分析方法。

技术领域

本发明涉及大气颗粒物毒性分析技术，特别涉及一种利用实时空气采样、多通道微流控技术与单个绿色荧光蛋白标记的活体酵母菌结合的新型生物传感器实时在线分析大气颗粒物毒性的方法，可应用于大气颗粒物对人体造成的健康效应的实时在线评估。

背景技术

近年来，中国多地频发重度雾霾，许多工作致力于研究其成霾的机理，其中燃煤、车尾气等列为重要的贡献源。大气颗粒物吸入后对于人体健康会造成一定的损害，包括引起呼吸道感染、过敏反应、癌症和婴儿的出生缺陷等等。最近几年越来越多的研究表明大气颗粒物的生物组分对其生物毒性具有非常重要的影响,包括血压增加等心血管疾病等。生物气溶胶颗粒作为一种特殊的颗粒物，具有独特的健康效应，主要表现在它能造成呼吸系统感染、导致过敏和毒性反应等三个方面。

大气颗粒物的毒性是生物与化学成分共同作用的结果，忽略其中任何一部分成分的研究结果都会具有局限性。目前的大气颗粒物毒理研究主要是离线的，利用小鼠或呼吸系统上皮细胞的模型，通过暴露高浓度的大气颗粒物来观测其生物毒性与健康效应。这种离线研究一般时效性差，而且采集到的空气样品随时间组分会发生一定的变化，从而影响其毒性的测定。此外，所用的小鼠或呼吸系统上皮细胞模型的灵敏度差，常常需要较高浓度的颗粒物才能观测到其生物效应，这与实际大气环境浓度有一定的差距，不能够很好地反推真实大气颗粒物毒性水平。大气颗粒物的毒性的监测需要实时、原位、全组分的高灵敏度的监测体系。国内外目前尚还没有发展出这种技术。

近年来，活体酵母菌作为一种活体传感器越来越受到关注，其中有关酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的研究最多。酵母菌通过表达特定蛋白来完成对外界环境刺激的响应。例如，酵母菌对外界活性氧(ROS)的特异性蛋白在外界活性氧的刺激下会显著增多，同时酵母菌对外界金属离子的刺激也会有特定的蛋白表达。研究表明颗粒物的氧化应激损伤是颗粒物健康效应的重要方式。此外，多项研究报道，酵母菌作为最简单的真核生物，其多种致病基因与人类的致病基因极其相似，所以利用酵母菌作为活体检测生物能够很好的推广到大气颗粒物对于人体健康效应的评估中去。

发明内容

为实现大气颗粒物对于人体的健康效应的实时在线评估，本发明提供了一种利用单个活体酵母微流控生物传感器快速分析大气颗粒物毒性的方法。

本发明的技术方案如下：

一种实时在线分析大气颗粒物毒性的方法，包括如下步骤：

1)筛选出对外界不同刺激有灵敏应激响应的酵母菌不同功能蛋白，并获得所述功能蛋白被绿色荧光蛋白(GFP)标记的不同酵母菌；

2)将步骤1)获得的不同功能蛋白标记的酵母菌的菌液分别通入微流控芯片的不同通道中作为生物传感器；

3)采集大气颗粒物，并将其混入酵母菌的液体培养基中，实时通入微流控芯片中，观测微流控芯片中不同功能蛋白标记的活体酵母菌绿色荧光的强度变化；

4)对荧光的强度随时间变化数值进行记录和定量分析，在蛋白分子水平实时评估大气颗粒物的毒性。