[发明专利]BCR基因和ABL基因检测探针及其制备方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，特别是涉及BCR基因和ABL基因检测探针及其制备方法和试 剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)是一种起源于造血干 细胞的克隆性骨髓增殖性肿瘤，主要累及粒细胞系，表现为持续、进行性外周血白细胞数量 增加。CML起病缓慢，初期症状不明显。其自然病程是由慢性期进展为加速期，最后发展为急 变期，急变后患者常在3～5个月内死亡。

90％以上患者白血病细胞中有恒定的、特征性的Ph染色体及其分子标志BCR/ABL 融合基因。Ph染色体绝大多数为t(9；22)(q34；q11)典型易位，少数患者有变异易位，包括22 号染色体与非9号染色体间简单变异易位，3条或更多条染色体间的复杂易位(隐匿易位)。 Ph染色体存在于CML的整个病程中，治疗缓解后，仍持续存在，因此采用骨髓移植，消除Ph阳 性克隆，才能达到最终治愈。

因此，通过对初诊患者进行BCR/ABL检测，可以诊断CML，进行酪氨酸激酶抑制剂受 益人群筛查。

荧光原位杂交(FluorescenceinsituhybridizationFISH)是20世纪80年代末 期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这 项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、 人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标 记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可 被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以 探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位 杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因 此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫 星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3) 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和 素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直接 标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。

而目前对于BCR/ABL基因FISH检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种BCR基因和ABL基因检测探针及其制备方法，所制备 的探针可用于检测BCR基因和ABL基因状态，即检测BCR基因和ABL基因检测，检测的融合类 型包括典型易位、变异易位和隐匿易位，具有很好的特异性。

实现上述目的的技术方案如下。

一种BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取针对BCR基因的BAC克隆为RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4中至少 一种，和选取BAC克隆为CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4中的至少一种；和选取针对 ABL基因的BAC克隆为CTD-2037L19、RP11-21G10、CTD-2526G20中至少一种；

(2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；

(3)用荧光素标记质粒DNA，针对BCR基因和针对ABL基因的检测探针标记的荧光素 的颜色不相同，且针对BCR基因中，来源于BAC克隆RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4的 探针与来源于BAC克隆CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4的探针的荧光素的颜色不相 同，即得。