[发明专利]一种转移质粒及其构建方法和重组慢病毒

权利要求书

1.一种转移质粒，其特征在于，其结构如图1所示。

2.一种如权利要求1所述的转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamHI和KpnI 双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bpCMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒 用BamHI和KpnI进行双酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和 pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE- CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bp Luciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段， 将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为 pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。

3.一种重组慢病毒，其特征在于，是包装质粒、包膜质粒和如权利要求1所述的转移质 粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒。

4.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所 示。

5.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQ IDNo.6所示。

6.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒的构建方法， 包括以下步骤：

psPAX2载体重建：利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI，获得psPAX2-1载体； 利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI，获得psPAX2-2载体；DpnI酶切 psPAX2-2载体，酶切产物转化XL10-GOLD感受态细胞，质粒提取，ApaI酶切该质粒，挑取酶 切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQIDNo.4所示；

psPAX2m-pol质粒构建：利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和 AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-pol质粒，其序列如SEQ IDNo.6所示。

7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2-1载体的序列如SEQID No.2所示。

8.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2-2载体的序列如SEQID No.3所示。

9.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m载体的序列如SEQID No.4所示。

10.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述长引物法突变psPAX2载体所 用的引物为AgeI-F和AgeI-R，其中，

AgeI-F：CGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATC；

AgeI-R：CTGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTATCGGTTGTTTCGAGCTTATAG；

模板为psPAX2，PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min， 循环35次，最后72℃延伸5min；

所述利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R；其 中，

M-ApaI-F：GCCTTGAGGGGCCTCCGGGGACGGCCCTTTGTGCGGGG

M-ApaI-R：CCCCGCACAAAGGGGCCGTCCCGGAGCCCCCTCAAGGC；

模板为psPAX2-1，PCR条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，55℃退火1min，68℃延 伸10min，循环18次。