[发明专利]一种转移质粒及其构建方法和重组慢病毒

说明书

技术领域

本发明涉及及医学分子生物学领域，具体涉及了一种转移质粒及其构建方法和重 组慢病毒。

背景技术

过去的数十年中，多种HIV-1抑制药物已批准入市，用于HIV感染病人的治疗。基于 HIV-1逆转录酶和(或)蛋白酶的两种或多种抑制剂联合应用的高效抗逆转录病毒疗法 (HAART)，被公认为是治疗HIV感染病人最有效方法之一。它不仅能够提高HIV感染病人的生 活质量也能降低HIV的感染风险。尽管HAART能够抑制病毒的复制和降低HIV感染的风险，但 不能清除HIV-1感染者体内的病毒。因此，抗逆转录病毒疗法会因药物选择性压力下新现的 耐药毒株而大打折扣。因此，很有必要监测耐药毒株并对临床精准抗病毒治疗提供指导。

目前，对于HIV-1药物耐药性检测主要有基因型和表型耐药两种检测类型。基因型 耐药检测是通过序列分析，能检出HIV-1靶基因中特定耐药相关的基因突变，因其操作简 便，成本低廉，及在线的评估系统的应用，较表型耐药检测常用。但是，基因型检测不能用于 解释不常见的突变或几种突变型的混合突变。表型耐药检测，能够在体外测定HIV-1抑制剂 作用下的病毒产量或酶活性，能够直接测定每种抑制剂的耐药水平，而无需知晓HIV-1毒株 的基因突变。因此，表型耐药检测对于HIV-1感染的病人，特别是为已经多次治疗的病人提 供精准的药物指导是很有意义的。通常情况下，表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但 是，这些检测需要采集献血者新鲜的外周血单个核细胞，这将耗时耗力。最近，有一些检测 基于重组病毒的单环感染，或用感染性粒子进行多轮感染。尽管这些检测用于表型耐药分 析有巨大的应用前景，但是，由于采用高通量定量萤火虫萤光素酶表达系统，成本还是很高 昂，再就是可能存在着生物安全问题。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种转移质粒，其报告基因 Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因 Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光 显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移 质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。本发明还提供了一种转移质粒的构建 方法及重组慢病毒。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

本发明的发明思路基于以下考虑。第一，在艾滋病人临床治疗工作中，表型耐药检测能 为患者个体化治疗提供参考。但是表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是，以往的检测 方法存在耗时耗力或是成本高昂，及生物安全性的问题。基于此，发明人开发了一种具有新 的转移质粒的重组慢病毒，它具有简易操作性、较好的生物安全性及通用性。

一种转移质粒，其结构如图1所示。

一种转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamHI和KpnI双酶切pMD2.G质 粒，回收酶切产物，收取119bpCMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和Kpn I进行双酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES- ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES- ZsGreen质粒；使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片 段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和 Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc- IRES-ZsGreen。

一种重组慢病毒，是包装质粒、包膜质粒和所述的转移质粒共转染293FT细胞或 293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒。

进一步地，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。

进一步地，所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQIDNo.6所示。

进一步地，所述psPAX2m-pol质粒的构建方法，包括以下步骤：