[发明专利]一种自体CIK细胞高效扩增方法

权利要求书

1.一种自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

S100、外周血单个核细胞的分离：从患者血液中分离外周血单个核细胞，悬浮备用；

S200、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物；

S300、自体CIK细胞的培养：将所述外周血单个核细胞小心铺入培养瓶中培养，培养时补加5％～20％的含有所述血小板聚集释放物的无血清培养基，并添加细胞因子IL2、IL1a、anti-CD3进行诱导，直至收获所述自体CIK细胞。

2.根据权利要求1所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤S100中还包括：

S101、准备全血：抽取肿瘤患者静脉血，加入抗凝剂成抗凝全血备用；

S102、外周血单个核细胞与自体血浆的分离：使用血细胞分离机或者淋巴细胞分离液将外周血单个核细胞从自体血浆中分离，获得的外周血单个核细胞粗品；

S103、外周血单个核细胞的处理：将所述外周血单个核细胞粗品用生理盐水或无血清培养基洗涤两次，20℃下500g离心3～7分钟，再用适量无血清培养基重悬，得到外周血单个核细胞，备用。

3.根据权利要求1所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述步骤S200中使用的所述磷酸盐缓冲液为含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150ng/g。

5.根据权利要求1所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述步骤S200中所述“分离获得血小板”的方法包括：

取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；800～1200g离心20～25min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

6.根据权利要求5所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述血小板分离液由聚蔗糖、泛影酸、去离子水配制而成，密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌后即得。

7.根据权利要求1所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述步骤S300中还包括：

S301、调整细胞浓度：用无血清培养液调整外周血单个核细胞的细胞浓度至1×10⁶～2×10⁶个/ml，混合均匀后小心铺入培养瓶中；

S302、预培养：向培养瓶中加入600U/ml～1400U/ml的IFN-γ、质量份数0.5％～2％血小板聚集释放物，培养24h～48h后；

S303、连续培养：补加600U/ml～1400U/ml的IL2、600U/ml～1400U/ml的IL1a、60ng/ml～150ng/ml的anti-CD3后继续培养，隔天取样计数，补充含质量份数0.5％～2％血小板聚集释放物的新鲜无血清培养基，将细胞的培养密度调整至1×10⁶～2×10⁶个/ml，直至收获所述自体CIK细胞。

8.根据权利要求7所述的自体CIK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述步骤S303中“补充含质量份数0.5％～2％血小板聚集释放物的新鲜无血清培养基”时，所述新鲜无血清培养基中还含有质量份数1％～2％人血清白蛋白、0.05％～0.2％重组人转铁蛋白或柠檬酸铁、0.05％～0.1％植物血凝素。