[发明专利]一种自体CIK细胞高效扩增方法

说明书

提供了一种自体CIK细胞高效扩增方法，该方法包括如下步骤：分离外周血单个核细胞、制备血小板聚集释放物、培养自体CIK细胞。该方法使用血小板聚集释放物替代常用的动物源性血清，还可以添加人血清白蛋白等已知成分的营养物质促进CIK细胞快速增殖。

技术领域

本发明涉及动物免疫细胞培养技术领域，更具体的说，涉及到一种自体CIK细胞高效扩增方法。

背景技术

在常规的自体CIK细胞培养过程中，需要使用大量动物源性血清如胎牛血清、新牛血清、小牛血清等，以细胞培养过程中必不可少的营养物质。如今，大部分实验室仍然还在用动物源性血清来培养细胞，但是随着血源的减少以及血清价格的不断上涨，以及来自动物保护组织的压力，动物源性血清的使用日益受到限制，另外，动物源性血清中的复杂成分会对所培养细胞照成较多的不确定性影响，不能准确放映出需要的生物学特性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：提供一种自体CIK细胞高效扩增方法，解决现有CIK细胞扩增方法中动物源性血清会给免疫反应带来不确定性影响的缺陷。

本发明解决上述问题的技术方案为：提供一种自体CIK细胞高效扩增方法，包括如下步骤：

S100、外周血单个核细胞的分离：从患者血液中分离外周血单个核细胞，悬浮备用；

S200、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入80～150μmol/L的二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物；

S300、自体CIK细胞的培养：将所述外周血单个核细胞小心铺入培养瓶中培养，培养时补加5％～20％的含有所述血小板聚集释放物的无血清培养基，并添加细胞因子进行诱导，直至收获所述自体CIK细胞。

在本发明提供的自体CIK细胞高效扩增方法中，所述步骤S100中还包括：

S101、准备全血：抽取肿瘤患者静脉血，加入抗凝剂成抗凝全血备用；

S102、外周血单个核细胞与自体血浆的分离：使用血细胞分离机或者淋巴细胞分离液将外周血单个核细胞从自体血浆中分离，获得的外周血单个核细胞粗品；

S103、外周血单个核细胞的处理：将所述外周血单个核细胞粗品用生理盐水或无血清培养基洗涤两次，20℃下500g离心3～7分钟，再用适量无血清培养基重悬，得到外周血单个核细胞，备用。

在本发明提供的自体CIK细胞高效扩增方法中，所述步骤S200中使用的所述磷酸盐缓冲液为含Ca²⁺、Mg²⁺的磷酸盐缓冲液。

在本发明提供的自体CIK细胞高效扩增方法中，所述血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150ng/g。

在本发明提供的自体CIK细胞高效扩增方法中，所述步骤S200中所述“分离获得血小板”的方法包括：

取枸橼酸抗凝全血或者富血小板血浆，将其小心铺层到血小板分离液的上层；800～1200g离心20～25min，吸取淋巴细胞分离液和血浆之间的血小板层。

在本发明提供的自体CIK细胞高效扩增方法中，所述血小板分离液由聚蔗糖、泛影酸、去离子水配制而成，密度为1.060g/L，渗透压为280mosm/L，0.22μm滤器过滤除菌后即得。

在本发明提供的自体CIK细胞高效扩增方法中，所述步骤S300中还包括：