[发明专利]酶法制备同质的抗体-药物缀合物

说明书

本申请在一个方面提供了含Fc多肽缀合物，其中含Fc多肽与缀合部分缀合，其中所述含Fc多肽包含N‑糖基化的Fc区，所述N‑糖基化的Fc区含有侧接N‑糖基化位点的受体谷氨酰胺残基，且其中所述缀合部分通过该受体谷氨酰胺残基与含Fc多肽缀合。还提供了通过使用野生型或工程改造的转谷氨酰胺酶制备此类含Fc多肽缀合物的方法。进一步提供了专门设计用于催化此类反应的工程改造的转谷氨酰胺酶。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年6月12日提交的第62/011,534号美国临时申请的优先权权益，所述美国临时申请以其全部内容通过引用并入本文。

背景

基于抗体的疗法已在各种病症（如癌症和免疫疾病）的靶向疗法中发挥了重要的作用。近年来，抗体-药物缀合物（ADC）已经被广泛地研究用于向靶位点有效递送药物。例如，化学修饰方法已广泛地用于将药物缀合至抗体，其通过赖氨酸侧链胺或通过半胱氨酸巯基实现。但是，这些缀合方法经常会导致产生具有不同药物与抗体的摩尔比、非特定缀合位点以及不同效力、安全性和药代动力学的不均一的缀合物混合物，参见Tanaka 等人,FEBS Letters 579:2092-2096(2005)。在抗体的特定位点构建反应性半胱氨酸残基从而实现缀合具有确定的化学计量学的特定药物的技术也已公开，参见Junutula 等人,NatureBiotechnology,26:925-932(2008)。然而，此类半胱氨酸工程改造的抗体和抗体-药物缀合物的表达和缀合需要冗长且复杂的反应步骤，例如参见Gomez 等人,Biotechnology andBioengineering,105(4):748-760(2009)。且在制备半胱氨酸工程改造的抗体和抗体-药物缀合物的过程中还可能会产生抗体聚集体。现有技术也已经公开了将非天然氨基酸残基整合入抗体中的方案，其中该非天然氨基酸残基作为位点特异性缀合的化学柄(chemicalhandles)，参见Axupa 等人,PNAS,109:16101-16106(2012)。该方案首先需要在表达宿主中整合入琥珀抑制子tRNA和氨酰-tRNA合成酶的正交对(orthogonal pair)。然后，突变体抗体可以在这种专门宿主中表达，该宿主需要在补充非天然氨基酸的培养基上培养。这种方法不仅耗费时间，而且抗体表达产量也很低。

近期，利用转谷氨酰胺酶制备ADC的酶促方法已被公开。转谷氨酰胺酶（TGase）通过转谷氨酰胺作用将含有胺供体基团的部分转移到受体谷氨酰胺残基上。人同种型的全长IgG抗体在其重链的295位含有一个保守的谷氨酰胺残基（Q295）。因为该谷氨酰胺残基紧密靠近N-糖基化位点（N297），通常认为当全长抗体是N-糖基化时会导致抗体上的Q295无法接近TGase。为了使TGase作用于全长抗体，通常在TGase介导的缀合之前，将抗体的Fc区去糖基化或者突变以去除N-糖基化位点，参见WO2013/092998。另一可选的方案是将含谷氨酰胺的序列“标签”插入到抗体的轻链或重链以获得受体谷氨酰胺位点，参见WO2012059882。因此，所有目前的位点特异性ADC技术都依赖于工程改造的抗体突变体，这可能会导致潜在的免疫原性和体内不稳定性。迫切需要一种有效的位点特异性的抗体缀合技术，其可直接使用完整抗体。

本文中引用的所有公开出版物、专利和专利申请以其整体通过引用并入本文。

发明概述

本发明在一个方面提供含Fc多肽缀合物，其中含Fc多肽与缀合部分位点特异性缀合，其中所述含Fc多肽包含N-糖基化的Fc区，其中所述N-糖基化的Fc区包含侧接N-糖基化位点的受体谷氨酰胺残基，且其中所述缀合部分通过该受体谷氨酰胺残基与含Fc多肽缀合。

在一些实施方案中，所述受体谷氨酰胺残基在其+2位置侧接N-糖基化位点。在一些实施方案中，N-糖基化的Fc区包含免疫球蛋白重链的氨基酸290至300，其中编号是根据Kabat索引确定。在一些实施方案中，N-糖基化的Fc区是天然存在的免疫球蛋白重链的Fc区。