[发明专利]通过使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵制造类胡萝卜素的方法

说明书

技术领域

该发明涉及一个通过使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵制造β-胡萝卜素或番茄红素的简单而高效的方法，该方法的突出特征是三孢布拉霉菌菌株的生产率高。高生产率是通过正确执行本发明的方法而实现的，执行过程中考虑了丝状生长的半菌株的形态状况以及混合菌株时的生长状态(也称为配对)。

背景技术

类胡萝卜素是天然染料，染色颜色黄色至红，往往出现在蔬菜中。作为抗氧化剂和维生素A的前体，类胡萝卜素一直是大量研究的对象。由于其抗氧化性，它们可以预防许多疾病，例如：癌症、动脉硬化、风湿病或阿尔茨海默氏症。其中，番茄红素(出现在例如西红柿中)具有最大的抗氧化能力，被认为能够有效对抗特别活性的单线态氧。工业上，类胡萝卜素被当做食品添加剂和着色剂用在人造黄油、油、酱汁、汤和果汁中，也用作动物饲料添加剂。

类胡萝卜素可使用化学和生物技术制造。通过生物技术生产的类胡萝卜素可以很容易具有复杂的结构以及自然出现的构象异构。生产β-胡萝卜素的工业生物技术工艺以使用盐生杜氏藻或者三孢布拉霉菌菌株为基础，其中使用三孢布拉霉菌时进行正负菌株混合发酵，以达到β-胡萝卜素的最大产量。

在现有技术水平，通过三孢布拉霉菌发酵制造β-胡萝卜素在众多专利文献中都有描述，例如在EP 1 367 131 A1、WO 93/20183 A1以及WO 02/010429 A1中。上述文献描述的发酵方法都基于一个原理：正的和负的半菌株共同在生物反应器中接种。WO 93/20183 A1描述了使用所选变异的三孢布拉霉菌菌株在特定发酵条件下生产β-胡萝卜素。WO 02/010429 A1披露了一种发酵方法，在发酵过程中通过定义的pH值调节并添加大豆卵磷脂作为培养基，从而提高β-胡萝卜素相对于其他类胡萝卜素的生产率。EP 1 367 131 A1中描述的发酵条件规定了编程化的氧和/或β-紫罗兰酮添加以及对所使用菌株营养生长阶段的控制。US 5,422,247 A和WO 2005/030976 A2中揭示了其它的发酵方法，其中包括对pH值以及必要时对氧分压的调节。

在文献中还描述了使用化学组分用于增产。但这样的成分可能有毒，另外，它们用于食物或药物目的时的合法授权可能有问题。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种生产类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和番茄红素的有效方法，不需要化学添加剂，但提供良好的产品产率。另外，它还应该成本尽量低，且执行简单、耗费少，并能减少发酵时间。

本发明的任务是通过使用三孢布拉霉菌正负菌株混合培养深层发酵制造β-胡萝卜素或番茄红素，从中选出类胡萝卜素并从获得的生物质或从发酵液油相获取类胡萝卜素的方法而完成的，其特征为，首先分别预培养正和负菌株至完全形成形态，然后将负菌株接种到生物反应器中并在负菌株指数式增长过程中将正菌株按1:5到1:100的体积比(也称为配对比)添加到负菌株中以诱导形成类胡萝卜素，两种菌株在18℃至24℃下，且无需pH值及氧分压调节地条件下发酵，必要时直至形成类胡萝卜素(繁殖期)结束。

在本发明的优选实施方案中，菌株分别预培养为26℃-30℃，特别优选为28℃。单独预培养负菌株要进行约55小时。约55小时后，负菌株被转移到生物反应器中。生物反应器中负菌株的发酵同样优选为26℃-30℃，特别优选为28℃。生物反应器中负菌株的培养要进行约13到14个小时(营养期)。

同样特别优选正负菌株共同发酵(繁殖期)形成类胡萝卜素在22℃下进行。

根据本发明，负半菌株的培养以反应器规模进行，直至完全形成菌丝(营养期)，然后在负菌株指数式增长过程中正半菌株会作为诱导措施添加进去。由此可以缩短发酵过程的时间并节省成本。此外，在营养期和繁殖期之间生长最佳温度也从26℃至30℃转换到18℃到24℃。较低的温度不仅不会抑制半菌株的活性，还能促进产品在发酵过程中的稳定性。本方法中，无需调节pH值或氧含量就能成功培养出产品并达到良好的产品产出率。由于无需调节pH值，所以无需添加酸或碱，因此节省了成本。

在整个产品形成(繁殖期)过程中放气速率、转速和温度保持恒定，这显然有利于真菌与主要条件匹配。产品形成使用的特征是BDS(生物干燥剂)含量和pH值同时降低。类胡萝卜素形成的终止标准可以通过pH值明显增加检测出来。也就是说，pH值增加0.5到0.8后，类胡萝卜素形成终止。

菌株在锥形瓶中单独预培养过程中的搅拌速度优选为130-156转/分钟。