[发明专利]层析方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种层析方法。更接近地，本发明涉及一种在用于纯化目标分子优选单克隆抗体mAbs的层析方法中除去大的污染物（例如病毒）的方法，通过使用具有薄的外层和用吸收所述mAbs或其部分的配体官能化的核的专门设计的层析珠。

发明背景

免疫球蛋白代表在世界范围内制造或开发中的最流行的生物药物产品。对该特别治疗市场的高商业要求和由此产生的价值导致重点被放在药物公司上以在控制相关成本的同时使其相应的mAb制造方法的生产率最大化。

在大多数情况下，亲和层析用作在纯化这些免疫球蛋白分子例如单克隆或多克隆抗体中的关键步骤之一。特别感兴趣种类的亲和试剂为能够特异结合到免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白质，这种相互作用独立于抗体的抗原-结合特异性。这种试剂可以广泛用于从不同样品（例如但不限于血清或血浆制剂或细胞培养物衍生的原料）亲和层析回收免疫球蛋白。这种蛋白质的例子为包含能够结合到来自不同物类的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的域的葡萄球菌蛋白质A。

由于其高亲和性和选择性，发现基于葡萄球菌蛋白质A (SpA)的试剂在生物技术领域中（例如在用于捕获和纯化抗体以及用于检测的亲和层析中）广泛使用。当前，基于SpA的亲和介质可能为最广泛使用的亲和介质，其用于从不同样品（包括来自细胞培养物的工业原料）分离单克隆抗体及其片段。因此，包含蛋白质A-配体的各种基质为市售可得的，例如为天然蛋白质A形式（例如蛋白质A SEPHAROSE™，GE Healthcare，Uppsala，Swenden）且还由重组蛋白质A（例如rProtein A SEPHAROSE™，GE Healthcare）构成。更特别地，在商业重组蛋白质A产品中实施的基因操作的目的在于促进其附接到载体。

病毒除去为在mAbs的下游纯化中的必要纯化步骤。病毒除去通过使mAb进料流过具有限定截流的专用病毒除去过滤器常规地实施，因此mAb经过过滤器而病毒的主要部分无法通过。

不管在免疫球蛋白生产期间的病毒除去的现有技术，仍然需要改进的产品和方法。

发明概述

第一方面，本发明涉及用于从较大污染物例如病毒纯化含免疫球蛋白蛋白质或其部分的方法，其包括：a）使含免疫球蛋白样品与包含具有限定的孔尺寸的薄盖(lid)和提供有亲和配体的限定的孔尺寸的内核的层析珠接触；b）将所述含免疫球蛋白蛋白质吸收到所述配体；c）清洗所述珠以除去任何污染物；和d）洗脱所述珠以释放捕获的含免疫球蛋白蛋白质或其部分。

所述层析珠的平均直径尺寸为10-500µm，例如10-50µm，50-100µm或250-450µm。所述层析珠可以例如用于精加工、捕获且在细胞培养物之后的中游使用。

根据例如高离析度或快速传质所需的具体应用，或当进料粘度高时，选择所述层析珠的尺寸。所述层析介质的平均尺寸例如计算为体积加权的中值直径。

所述盖的厚度为1-8µm，优选3-5μm。所述盖厚度可以根据全部珠尺寸有利地变化。例如，在一些实施方案中，具有较薄盖以便保持高的结合容量是合乎需要的。在其他实施方案中，当病毒对数降低比结合容量更重要时，设计具有较厚盖的层析介质为有利的。

当mAb或Fab为目标时，所述盖优选为无活性的，即不提供有任何相互作用的配体。所述盖厚度可以通过共焦显微镜，通过切片机切片或常规显微镜测量。

所述盖和核的孔尺寸对应于0.1-1的K_D，优选0.3-0.7，其用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。本发明适用于大于20000D的目标分子，例如约150000D的Mab。所述孔尺寸对容量而且对选择性具有重要性。在溶胀材料例如琼脂糖和其他多糖凝胶中，所述孔尺寸最好通过反向排阻层析方法评估，其中测定探针分子（例如Mw 110 kDa的葡聚糖）可通过的体积分数K_d。在例如L Hagel等人:J Chromatogr A 743，33-42(1996)中描述了这种方法。

所述盖和核的孔尺寸可以为相同的或不同的。对于Mabs和Fabs的纯化，优选为相同的。

在优选的实施方案中，所述盖和核的孔隙率为0.30-0.95，优选约0.60-0.85。所述盖和核的孔隙率可以为相同的或不同的。

在所述盖和核中的孔隙率或孔密度差可以通过产生层析介质的条件的变化获得，例如使用不同的量和百分数的珠材料、交联剂、盐和收缩剂。所述层析介质的孔隙率也可以通过在珠颗粒的不同层中选择性加入将物理和化学降低孔隙率的不同的带电或不带电的化学实体来改性。