[发明专利]连接蛋白半通道的特异性调节剂

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定由连接蛋白形成的半通道的特异性调节化合物(阻断剂)的方法、在此方法学下所鉴定的化合物的新用途和包括这些化合物以用于治疗与由连接蛋白形成的半通道的活性增加相关的疾病的药物组合物，所述疾病诸如炎性疾病、血管紊乱、心律失常、慢性损伤、视网膜神经保护，疼痛治疗，骨骼肌去神经支配，肌营养不良，缺血后再灌注(例如：心脏或脑梗塞)，脊髓损伤和以由连接蛋白形成的半通道的活性增加为特征的遗传疾病。

背景技术

连接蛋白(connexin)为内在膜蛋白，其在原生质膜中呈六边形布置，即称之为连接子或半通道。两个半通道可通过它们的胞外片段结合在一起以便形成通道间隙连接或者间隙连接，这允许许多物质在细胞间直接转移(Sáez,Merthoud et al.2003)。在过去的十年里，已经显示出在生理条件下，半通道在代谢产物和营养物的转移中发挥了重要作用(Chandrasekhar and Bera 2012)，而且其在细胞间信号分子(诸如ATP、谷氨酸、前列腺素E2和NAD⁺)的释放中也发挥了重要作用，提供了用于自分泌和旁分泌信号在膜中的路径(Wang,De Bock et al.2012)。但是，在不同的病理条件下，由连接蛋白形成的半通道的活性被上调，且显著促进细胞变性的结果(Sáez,Schalper et al.2010)。

最近通过X射线晶体学的至分辨率的连接蛋白的晶体结构测定(Maeda et al.2009)显示半通道是间隙连接的保守动机，且它们可被看作结构单元模块(Yeager,2009)。由连接蛋白26形成的半通道结构显示每个单体由4个跨膜α螺旋(TM1-TM4)、2个胞外环(E1、E2)、1个胞内环以及一个N-端螺旋结构域(NTH)和C-端结构域组成。每个连接包含6个原体的布置且连接蛋白26的每个单体包含典型的四螺旋束，其中任何相邻的螺旋对是反平行的(Maeda and Tsukihara,2011)。连接蛋白26的第二种结构的布置如下：各自地，TM1、TM2和E1面向孔；TM3、TM4和E2分别位于半通道的周边中，所述半通道在膜脂或胞外环境之前；TM2和TM1位于细胞质中的一半被NTH覆盖，且它们没有被暴露(图1)。

数条研究表明由连接蛋白形成的通道的特异性抑制剂的应用能够在癫痫，心律失常，癌症，中风或其它状况中具有治疗作用(Spray,Rozental et al.2002)。虽然通过电生理技术和采用重组蛋白的体外实验已经可以鉴别据说能直接作用在半通道或者通道以调节它们的功能的药物，但是对于大部分(若非全部)到目前为止所报道的由连接蛋白形成的半通道抑制剂，它们的活性通过何种精确机制来调节以及转运的特性仍旧未知(Juszczak and Swiergiel 2009)。此外，到目前为止所描述的所有化合物在微摩尔浓度都是有效的，这显示它们几乎不具有选择性且它们中的许多还阻断了由panexin形成的半通道(Varselis and Srinivas 2013)。因此，迫切地需要药理学工具以进一步明确它们的功能并验证它们作为药理学靶标，用于发展针对基于连接蛋白功能紊乱的疾病的新的治疗方法(Bodendiek and Raman 2010)。

目前存在数种连接蛋白调节剂，但是它们中的大多数同时影响由连接蛋白形成的半通道和通道的活性。此外，抑制连接蛋白表达的反义RNA或者吗啉代的使用消除了半通道和间隙连接两者的表达。因此，现有技术中所描述的化合物显示出几乎没有功效和非特异性的作用机制或非特异性继发于其它修饰连接蛋白活性的治疗靶标(例如激酶)的药理学作用。

在现有阶段中存在描述了调节由连接蛋白形成的半通道的活性的组合物和方法的例如EP1469875,US7153822,WO2003063891,US20040092429,US20070042964 y WO2006134494专利或专利申请。在这样的文献所提出的机制中，存在连接蛋白43的C-端片段中的酪氨酸残基的磷酸化，通过采用肽模拟物阻断了2个半通道的结合，所述肽模拟物与半通道或者其跨膜区之间的结合区域类似，所述跨膜区修饰半通道的形成。但是，这些化合物对通过半通道的转运没有选择性，而且它们还非特异性地影响间隙连接通道，。