[发明专利]用于双特异性抗体的纯化平台

权利要求书

1.一种制备蛋白质的方法，包括：

(a)用包含(i)包含两个拷贝的第一多肽的第一同二聚体、(ii)包含两个拷贝的第二多肽的第二同二聚体和(iii)包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的多聚体蛋白质混合物加载亲和基质，其中第一多肽具有对蛋白A配体的亲和力，并且第一多肽对亲和基质的亲和力大于第二多肽，其中亲和基质包含固定于基材的蛋白A配体，所述基材包括多个平均直径为45μm的颗粒，并且包括平均直径为的孔；和

(b)在包含CaCl₂或MgCl₂并具有第一pH范围的缓冲液中从亲和基质洗脱和收集异二聚体，

其中第一同二聚体在第二pH范围的缓冲液中从亲和基质洗脱，并且第二同二聚体在第三pH范围的缓冲液中从亲和基质洗脱，其中第三pH范围包含比第一pH范围更高的pH，第一pH范围包含比第二pH范围更高的pH。

2.根据权利要求1的方法，其包括以下步骤：

(c)将步骤(b)的收集的异二聚体应用于具有酸性pH的缓冲液中的多模式层析树脂；

(d)在具有更碱性pH的缓冲液中从多模式层析树脂洗脱异二聚体；和

(e)收集异二聚体。

3.根据权利要求1或2的方法，其中基材包括琼脂糖、聚(苯乙烯二乙烯基苯)、聚甲基丙烯酸酯、纤维素、受控的孔隙玻璃和球形二氧化硅中的任何一种或多种。

4.根据权利要求1或2的方法，其中每升亲和基质加载5至50克蛋白质。

5.根据权利要求1或2的方法，包括对步骤(a)中的经加载的亲和基质施加pH梯度。

6.根据权利要求5的方法，包括在施加pH梯度之前用pH 6-8的溶液洗涤步骤(a)中的经加载的亲和基质。

7.根据权利要求5的方法，其中pH梯度在pH 6和pH 3之间进行。

8.根据权利要求6或7的方法，其中第一pH范围在pH 5.5和pH 3.6之间。

9.根据权利要求8的方法，其中缓冲液包含乙酸盐。

10.根据权利要求9的方法，其中缓冲液包含40mM乙酸盐。

11.根据权利要求1或2的方法，其中缓冲液包含CaCl₂。

12.根据权利要求1或2的方法，其中缓冲液包含MgCl₂。

13.根据权利要求11的方法，其中缓冲液包含250-500mM CaCl₂。

14.根据权利要求12的方法，其中缓冲液包含250-500mM MgCl₂。

15.根据权利要求1或2的方法，其中异二聚体是抗体，并且第一多肽包含能够结合蛋白A配体的CH3结构域，并且第二多肽包含不能结合蛋白A配体的CH3结构域。

16.根据权利要求15的方法，其中根据EU编号，第二多肽在其CH3结构域中包含H435R和Y436F的取代。

17.根据权利要求16的方法，其中异二聚体是双特异性抗体。

18.根据权利要求1的方法，其中多聚体蛋白质的混合物由细胞培养物中的多个真核细胞产生。

19.根据权利要求18的方法，其中真核细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物。