[发明专利]用于双特异性抗体的纯化平台

说明书

使用离液剂和pH梯度或pH步骤洗脱缓冲液的高分辨率蛋白A层析导致密切相关的分子物质之间的峰分辨率改善。含有与蛋白A结合CH3结构域配对的蛋白A结合‑消除取代的CH3结构域的双特异性抗体以高峰分辨率与含有蛋白A结合‑消除取代的CH3结构域配对的蛋白A结合‑消除取代的CH3结构域的单特异性抗体和含有与蛋白A结合CH3结构域配对的蛋白A结合CH3结构域的单特异性抗体分离。有用的离液剂包括氯化镁和氯化钙。

发明领域

提供了通过亲和层析从蛋白质的复杂混合物中纯化特定多聚体蛋白质的方法。具体地，提供了使用离液剂通过亲和层析(包括蛋白A层析)从单体和同二聚体的复杂混合物中分离异二聚体(包括双特异性抗体)的方法。

发明背景

已经提出了多种双特异性抗体形式，并且目前正在开发中。一种这样的形式基于具有改进的药代动力学特征和最小免疫原性的标准完全人IgG抗体(参见美国专利号8,586,713，其全文并入本文)。单个共同轻链和两个不同重链组合以形成双特异性。重链之一含有取代Fc序列(以下称为“Fc*”)，其降低或消除Fc*与蛋白A的结合。例如一个这样的Fc*序列在CH3结构域中含有H435R/Y436F(由EU编号系统编号；由IMGT外显子编号系统编号则其为H95R/Y96F)的取代。作为两条重链和共同轻链的共表达的结果，产生三种产物：其中两种对于重链是同二聚体的，并且其中一种是所需的异二聚体双特异性产物。由于与高亲合力FcFc重链同二聚体或弱结合Fc*Fc*同二聚体相比的对于蛋白A的中间结合亲和力，Fc*序列允许在市售亲和柱上选择性纯化FcFc*双特异性产物。

为了实现双特异性异二聚体的商业规模纯化，需要FcFc同二聚体、Fc*Fc异二聚体和Fc*Fc*同二聚体之间的良好分辨率。这里，本发明的申请人描述了优化这三种分子形式的分辨率的改进的分离工艺。

发明概述

在本发明的一个或多个方面和实施方案中，本发明涉及通过使用亲和捕获洗脱工艺从包括同二聚体和异二聚体的蛋白质的复杂混合物中纯化异二聚体蛋白质例如双特异性抗体的方法。一方面，本发明涉及通过这些方法中的任一种产生的纯化的异二聚体蛋白。

在第一方面，本发明涉及制备蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：将多聚体蛋白质的混合物加载到亲和基质上，然后在特定的pH范围和在含有离液剂的缓冲液中从该基质洗脱并收集异二聚体蛋白质。在一个实施方案中，亲和基质最初加载有5至50克蛋白质/升亲和基质。在一些情况下，多聚体蛋白质的混合物由多种真核细胞产生，例如细胞培养物中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在一个实施方案中，多聚体蛋白质的混合物含有(i)包含两个拷贝的第一多肽的第一同二聚体，(ii)包含第一多肽和第二多肽的异二聚体，和任选地(iii)包含两个拷贝的第二多肽的第二同二聚体。这里，第一和第二多肽对亲和基质具有不同的亲和力，使得可以基于与亲和基质的差别结合来分离第一同二聚体、异二聚体和第二同二聚体。

可以通过特别是改变通过亲和基质的溶液的pH和/或离子强度来操纵与亲和基质的差别结合。向溶液中加入离液剂增强了从亲和基质中洗脱每种二聚体物质，从而提高了每种个体二聚体物质的纯度。在一个实施方案中，在具有第一pH范围的缓冲液中从亲和基质洗脱异二聚体，并且在具有第二pH范围的缓冲液中从亲和基质洗脱第一同二聚体。收集异二聚体。在任选的实施方案中，其中第二同二聚体包括在多聚体的混合物中，第二同二聚体或者流穿柱而不结合，或者在具有第三pH范围的洗涤缓冲液中从亲和基质洗脱第二同二聚体。第三pH范围包括比第一pH范围更高的pH，第一pH范围包括比第二pH范围更高的pH。