[发明专利]重复补料分批培养方法

说明书

本文提供了培养微生物的方法。所述方法包括提供包含一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积。培养微生物和培养基直至所述培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给所述培养物，并且其中当达到所述阈值指标时，所述培养物处于阈值体积。所述方法还包括收获阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积，并向所述容器中加入使所述培养物的体积返回到所述起始体积的量的新鲜培养基。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年10月16日提交的美国临时申请No.62/064,694的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

包括破囊壶菌(Thraustochytrid)种(species)在内的微生物的异养发酵是产生高价值油和生物质产物的有效方式。在某些培养条件下，微生物合成细胞内油，所述细胞内油可以被提取并用于生产生物燃料(生物柴油、生物喷射燃料等)和营养脂质(多不饱和脂肪酸，例如DHA、EPA、DPA)。微生物(例如，破囊壶菌种)的生物质因高PUFA和蛋白质含量而具有很高的营养价值，并且可以用作动物饲料的营养补充剂。

微生物发酵工艺主要以分批工艺或补料分批工艺进行。分批工艺通常涉及封闭系统培养，其中在特定条件(例如，特定水平的营养物、温度、压力等)下使细胞在固定体积的营养物培养基中生长至发酵罐中的特定密度，收获，并按批处理。在典型的补料分批工艺中，将一种或更多种营养物供给或供应至发酵罐，它们在发酵罐中保留直至培养过程结束。当控制一种营养物(或多种营养物)的浓度影响所需产物的产量或活性时，补料分批培养工艺可优于分批培养工艺。产油发酵工艺通常包括两个培养阶段：细胞增殖阶段，在此期间所有必需的营养物均可用于无限的培养物生长，随后是油积累阶段，在此期间关键的生长营养物(通常为氮)被有目的地限制在培养基中，同时提供过量的碳营养物并导入油合成。当达到目标细胞浓度和油含量时，停止发酵过程并收获富含油的生物质。然后必须对发酵罐容纳物(vessel)进行清洁、灭菌和用新鲜培养基重新分批，并且种子培养物(seed train)需要准备好用于再次接种生产容纳物(例如，分批/补料分批发酵之间的“周转”操作)。这样的周转操作通常耗时间和能量并且限制用于建成的生产工艺的生产容纳物的总可用操作时间。或者，可以采用连续方法培养微生物，其中将新鲜培养基连续加入发酵罐中，同时连续除去培养液以保持培养体积恒定。连续培养工艺可用于将微生物维持在特定的生长速率或生理稳态，但是可能难以在没有破坏的情况下维持并且通常用于研究目的，因为补料分批或分批培养倾向于提供更好的结果(例如，更高的产油率)，并且更易于用于大规模生产目的。

发明概述

本文提供了培养微生物的方法。所述方法包括提供含有一种或更多种微生物和培养基的容器，其中所述微生物和培养基形成起始体积，在培养基中培养微生物直到培养物达到阈值指标，其中培养包括将一种或更多种碳源供给培养物，并且其中当达到所述阈值指标时，所述培养物处于阈值体积，收获所述阈值体积的一部分以留下所述起始体积的40％或更小的剩余体积，以及向所述容器中加入使培养物的体积返回到起始体积的量的新鲜培养基。

附图简述

图1是显示在30L发酵罐中的重复补料分批发酵期间，容器内生物质浓度和油浓度随时间的进展的图。

图2是显示在30L发酵罐中贯穿重复补料分批发酵的生物质产率和油产率提高以及补料分批发酵的恒定生物质产率和油产率的图。图例中的RFB表示重复补料分批。

图3是显示在7L发酵罐中重复补料分批发酵期间，容器内生物质浓度和油浓度随时间的进展的图。

图4是显示在7L发酵罐中贯穿重复补料分批发酵的生物质产率和油产率提高以及补料分批发酵的恒定生物质产率和油产率的图。图例中的RFB表示重复补料分批。

图5是显示改变剩余种子体积(20％、30％和40％)对总平均生物质和油产率的影响的图。轴中的RFB表示重复补料分批。