[发明专利]哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法

说明书

本发明涉及哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法，更具体而言，涉及一种在进行聚合酶链反应中，能够在每个第一周期的与模板结合之前排除非特异性扩增产物的利用了哑铃结构寡核苷酸的多重基因扩增及单核苷酸多态性分析方法。本发明在聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)时，利用哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)，在常温下抑制非目的扩增产物，因而通过减少非特异扩增产物，能够高效提高敏感度和特异度，改进基因扩增方法，所述哑铃结构寡核苷酸通过附加任意碱基序列和3`‑末端模板依赖型特异碱基序列以及使该两种碱基序列连接的普适碱基对而生成，并且将所述哑铃结构寡核苷酸的5'‑末端寡核苷酸和3`‑末端寡核苷酸设计成在每个第一周期的与模板结合之前互补结合。

技术领域

本发明涉及哑铃结构寡核苷酸(dumbbell structure oligonucleotide,DSO)、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法，更具体而言，涉及一种在进行聚合酶链反应中，能够在每个第一周期的与模板结合之前排除非特异性扩增产物的利用了哑铃结构寡核苷酸的多重基因扩增及单核苷酸多态性分析方法。

背景技术

现在，研究人员为了获得基因试样而最普遍使用的方法是利用了DNA聚合酶的聚合酶链反应方法。聚合酶链反应中所利用的寡核苷酸被设计成结合于模板DNA相反一侧链。所述方法任意调节、设计能够与模板DNA结合的寡核苷酸的长度和碱基序列，从而具有能够只使靶基因的所需部位准确地扩增的优点，相反，由于一次反应只能使一个目的基因扩增，在要扩增的目的基因数量较多的情况下，存在需要重复执行同一作业的缺点。

为了解决这种问题，正在致力于开发将两种以上的模板基因和与各个模板基因相应的引物混合成为一体而进行聚合链反应的诸多方法，而且，为了改善引物的结合特异性并据此能够实现产物的扩增而开发了许多方法。诸如降落PCR(Don et al.,1991)、热启动PCR(DAquila et al.,1991)、巢式PCR(Mullis and Faloona,1987)及加强PCR(Ruano etal.,1989)。作为此外的其它接近方式，利用各种增强剂化合物，改善PCR的特异性，在这些增强剂化合物中，包括有有效提高结合反应温度的化学物质、DNA结合蛋白、可商业利用的反应物质等。但是，在所有PCR方法中，无法导出并获得成功的结果物，在多种结合温度条件下测试这些添加物是需要投入大量时间和精力的工作。虽然所述接近方式在改善引物退火特异性方面发挥某种程度的贡献，但所述这些方法却无法成为对于由用于PCR扩增的引物所导致的诸如非异物性产物及高背景问题的根本解决方案。另外，一次能够成功扩增的基因数量仅为3至4个，未改善各基因间的竞争或干扰效应、非特异性产物的扩增等缺点，实质上无法使用。

于是，为了进行多重聚合酶链反应及等位基因特异PCR，必须使目的模板基因的条件最优化，为此需要承受大量时间和精力及样品的消耗，由于如此最优化的条件并不适用于其它基因，为了克服这种问题，开发了接头聚合酶链反应(Linker PCR)或通过连接介导的聚合酶链反应(Ligation Mediated PCR)(参照：Journal of Clinical Microbiology,43(11)：5622-5627,2005)等方法。但是，接头聚合酶链反应由于将在第一管中反应的产物一部分转移到第二管并进行反应的实验特性，存在可能发生严重的交叉污染问题，连接介导聚合酶链反应由于利用了多种酶的复杂实验方法给研究人员带来困难，因而只在一部分情况下利用这种实验方法。