[发明专利]制备腺垂体或其前体组织的方法

说明书

本发明提供用于在体外从人多能干细胞衍生腺垂体或其前体组织的方法。在该方法中：通过在含有骨形态发生因子信号转导途径激活剂和Shh信号途径活性物质的培养基中对人多能干细胞聚集体进行悬浮培养而得到包含下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的人细胞聚集体；并且通过在含有骨形态发生因子信号转导途径激活剂和Shh信号途径活性物质的培养基中对所得到的包含下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的人细胞聚集体进行进一步悬浮培养，在表皮外胚层中诱导垂体基板和/或拉特克囊的形成，从而得到包含1)下丘脑神经上皮组织和2)垂体基板和/或拉特克囊的人细胞聚集体。

[技术领域]

本发明涉及用于在体外诱导多能干细胞分化成腺垂体或其祖先组织的技术。

[背景技术]

垂体(hypophysis)是邻近间脑下部的小的内分泌器官，并且作为多种激素的控制中心起主要作用。例如，其产生多种垂体激素，包括促进生命支持所必需的皮质类固醇产生的促肾上腺皮质素(ACTH)，促进儿童生长的生长激素等。因此，垂体的机能障碍引起严重的系统疾病。然而，由于垂体是通过胚胎中极其复杂的发育过程形成的，所以难以由干细胞如胚胎干(ES)细胞等形成垂体组织。

本发明人应用快速聚集胚状体样聚集体无血清悬浮培养(Serum-free Floatingculture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation，SFEBq法，所述方法被确定为一种有效地由诸如ES细胞等的多能干细胞分化神经细胞和视网膜细胞的方法)，并且在体外成功地由小鼠ES细胞自组织了垂体(非专利文件1)。在该方法中，通过在包含SAG的无血清培养基中悬浮培养小鼠ES细胞的聚集体激活hedgehog信号，并且同时在所述聚集体中形成下丘脑和口腔外胚层，并且其相互作用诱导垂体基板形成和拉特克囊的自组织。据报道，基于抑制实验，在该方法中，内源性BMP4信号是垂体基板形成所需要的。

[文献列表]

[非专利文件]

非专利文件1:Nature.2011Nov 9；480(7375):57-62

[发明概述]

[发明解决的问题]

旨在由人多能干细胞自组织垂体，本发明人将上述方法应用于人多能干细胞。然而，他们不能如在小鼠中那样实现有效的垂体形成。

因此，本发明的目的在于提供一种在体外由人多能干细胞有效诱导腺垂体或其前体组织的技术。

[解决问题的方式]

首先，本发明人添加对小鼠系统是外源性的BMP4，并且验证其作用。然而，在小鼠系统中，尽管添加外源性BMP4信号促进表面外胚层的形成，其相反对细胞聚集体内部神经上皮组织(下丘脑)的形成起抑制性作用，并且难以形成包括表面外胚层和下丘脑神经上皮组织二者的细胞聚集体。然而，出乎意料地发现，在使用人多能干细胞的系统中，与小鼠不同，外源性BMP4促进在表面上形成表面外胚层和在内部形成下丘脑神经上皮组织二者。当在包含BMP4和SAG的培养基中悬浮培养人多能干细胞的聚集体时，在细胞聚集体中同时形成下丘脑神经上皮组织和表面外胚层二者，并且通过其相互作用在表面外胚层中形成垂体基板。垂体基板内陷到内部，并且形成拉特克囊样囊结构。连续培育导致在垂体基板和拉特克囊中出现ACTH生产细胞、GH生产细胞和PRL生产细胞。含有垂体基板或拉特克囊的细胞聚集体响应CRH刺激分泌ACTH，并且ACTH分泌以反馈方式受糖皮质激素的抑制。因此，表明所述细胞聚集体具有响应下丘脑的刺激和来自下游靶组织的反馈调节以与机体内的垂体相同的方式控制垂体激素分泌的能力。

本发明人基于上文提及的发现进行了进一步的研究并且完成了本发明。

因此，本发明如下所述：