[发明专利]从生物样品中分离微泡和提取核酸的方法

说明书

本发明提供用于从生物样品中分离核酸、包括游离DNA和/或游离DNA和包括至少来自微泡的RNA的核酸以及用于从所述微泡和/或从所述生物样品中提取核酸的新型方法和试剂盒。

相关申请

本申请要求2014年7月9日提交的美国临时申请号62/022,538、2014年11月14日提交的美国临时申请号62/079,763和2015年5月27日提交的美国临时申请号62/166,890的优先权和权益，上述美国临时申请中每一者的内容以全文通过引用并入本文。

发明领域

本发明提供用于从生物样品中分离核酸、包括游离(cell-free)DNA和/或游离DNA和包括至少来自微泡的RNA的核酸以及用于从微泡和/或从生物样品中提取核酸的新型方法和试剂盒。

背景

细胞脱落的膜囊泡统称为微泡。来自各种细胞来源的微泡已关于蛋白质和脂质含量被广泛研究。最近，已发现微泡还含有DNA和RNA两者，包括基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、微RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)。

由于细胞所脱落微泡中含有的遗传和蛋白质组信息，当前研究指向利用微泡来获得对这些细胞的状况的进一步洞悉，例如疾病状态或疾病素因。另外，当前研究还指向利用游离DNA来获得对细胞状况的进一步洞悉。

因此，需要分离游离DNA和从生物样品中分离微泡的方法以及提取高质量核酸的方法，以用于医疗状况和疾病的准确诊断。

发明内容

本发明提供用于从样品中分离游离DNA(“cfDNA”，还称作循环DNA)和/或组合分离cfDNA和包括至少来自微泡的RNA的核酸的方法，所述方法通过将DNA、DNA和RNA和/或微泡捕获至表面，随后裂解微泡以释放其中含有的核酸、特别是RNA，并且从捕获表面洗脱DNA和/或DNA和包括至少RNA的核酸。本领域普通技术人员将理解微泡部分(microvesiclefraction)还包括DNA。因此，微泡部分的裂解释放RNA和DNA两者。此外，分离的DNA可来自各种来源中的任何一种，包括但不限于核小体和其他游离DNA来源。

用于从样品中分离和提取核酸、例如cfDNA和/或DNA和包括至少来自样品的微泡部分的RNA的核酸的以前的程序依赖于使用超速离心，例如以多于10,000×g旋转1-3hr，接着移除上清液，洗涤小丸，裂解小丸和在柱上纯化核酸例如DNA和/或DNA和RNA。这些以前德方法展现出若干缺点，诸如缓慢、乏味，经受批间可变性，和不适合于可扩展性。本文提供的用于分离和提取的方法和试剂盒克服了这些缺点，并且提供基于旋转的柱以用于快速、稳健和可容易扩展至大体积的分离和提取。

所述方法和试剂盒使用在本文中称为“EXO52”的以下通用程序来从样品中分离和提取核酸、例如DNA和/或DNA和包括至少RNA的核酸。首先，使样品中的核酸例如DNA和/或DNA和微泡部分结合至诸如膜过滤器的捕获表面，并且洗涤捕获表面。然后，使用试剂来执行核酸例如DNA和/或DNA和RNA的膜上裂解和释放。然后，使用PLG管执行氯仿提取，接着是乙醇调节。然后，使核酸例如DNA和/或DNA和RNA结合至硅胶柱，洗涤和洗脱。

EXO52方法和试剂盒中使用的膜具有大孔并带正电。在一些实施方案中，在EXO52方法和试剂盒中使用多于一个膜，例如，使用两个或更多个膜。在一些实施方案中，使用三个膜。在EXO52方法和试剂盒中使用的膜数与可一次分析的样品总体积相关。在一些实施方案中，EXO52方法和试剂盒中使用的每层膜处理约1ml样品。

在一些实施方案中，所述膜是带正电膜。在一些实施方案中，所述捕获表面是阴离子交换剂。在一些实施方案中，捕获表面是具有季胺的阴离子交换剂。在一些实施方案中，捕获表面是Q膜，其为带正电膜和具有季胺的阴离子交换剂。例如，Q膜用季铵官能化，R-CH₂-N⁺(CH₃)₃。在一些实施方案中，膜具有至少3μm的孔径。