[发明专利]阿魏酸转化为香草醛的方法

权利要求书

1.一种将阿魏酸转化为香草醛的拟无枝酸菌属ATCC 39116培养物–突变体拟无枝酸菌属ATCC 39116Δvdh(F33)，根据以下方法得到，其包括以下步骤：

(a1)用NaeI/SacII消化大肠杆菌‐拟无枝酸菌穿梭载体p6apra以删除拟无枝酸菌复制起点的主要部分，从而得到含有用于在大肠杆菌中复制的oriV、安普霉素抗性基因和一些用于克隆的独特限制位点的片段(3575bp)；

(a2)重新接合片段并用得到的质粒p6sui转化大肠杆菌；

(a3)由pSETGUS分离葡萄糖醛酸苷酶基因作为SpeI/EcoRV片段并克隆至NheI/DraI‐线性化自杀质粒p6sui，得到p6suigusA；

(a4)通过同源重组删除vdh基因，其中使用以下低聚核苷酸扩增拟无枝酸菌属ATCC 39116基因组中vdh的上游和下游侧翼区：

上游区域：

vdhLF_for3(5’‐TCGTACTTCGCGGTGATCTCGTGG‐3’)

和

vdhLF_rev_RF(5’‐GCGCATCAGGAGTGACACGCGCGGCGGGGGCG‐3’)；

下游区域：

vdhRF_for_LF(5’‐CGCCCCCGCCGCGCGTGTCACTCCTGATGCGC‐3’)和

vdhRF_rev3(5’‐TTGCAGTCCTTTGTAGAGCGACACG‐3’)；

(a5)纯化得到的扩增物并在随后的使用引物vdhLF_for3和vdhRF_rev3的融合PCR中结合；

(a6)将得到的包括vdh上游和下游区域的片段Δvdh克隆至自杀质粒p6suigusA的EcoRV‐位点；

(a7)由大肠杆菌移除得到质粒p6suigusA::Δvdh并将载体转运至拟无枝酸菌属ATCC 39116；以及

(a8)根据正确基因型选择拟无枝酸菌属ATCC 39116的转化体并培养得到第二重组子。

2.一种将阿魏酸转化为香草醛的拟无枝酸菌属ATCC 39116培养物–突变体拟无枝酸菌属ATCC 39116Δvdh::permE*::echfcs(F84)，根据以下方法得到，其包括以下步骤：

(b1)用NaeI/SacII消化大肠杆菌‐拟无枝酸菌穿梭载体p6apra以消除拟无枝酸菌复制起点的主要部分，得到含有用于在大肠杆菌中复制的oriV、安普霉素抗性基因和一些用于克隆的独特限制位点的片段(3575bp)；

(b2)重新接合片段并用得到的质粒p6sui转化大肠杆菌；

(b3)由pSETGUS分离葡萄糖醛酸苷酶基因gusA作为SpeI/EcoRV片段并克隆至NheI/DraI‐线性化自杀质粒p6sui，得到p6suigusA；

(b4)使用低聚核苷酸由拟无枝酸菌属ATCC 39116基因组DNA一起扩增ech和fcs基因

ech_for_SacI(5’‐AAAAGAGCTCTAAGGAGGTGACAACTGCTGGC CGCGCTCG‐3’)

和

fcs_rev_XbaI(5’‐AAAATCTAGACCACAGAGTAGCCGCAGCGGG‐3’)；

(b5)用SacI和XbaI消化PCR产物并随后将其克隆至SacI/XbaI‐线性化pBluescript SK^‐；

(b6)将得到的质粒pSK::echfcs转运至大肠杆菌Mach‐1T；

(b7)用EcoICRI和HindIII消化pSK::echfcs，并用与permE*共线的FspAI/HindIII‐线性化表达载体p6permE连接得到的含有两个基因的片段；

(b8)使用低聚核苷酸由得到的质粒p6permE::echfcs扩增含有启动子permE*以及ech和fcs基因的片段

p6apraMCS_for(5’‐GCGAGCACCGGAGGCAGG‐3’)和

p6apraMCS_rev(5’‐CATTCATCCGGGGTCAGCAC‐3’)

(b9)将平端PCR产物克隆至HincII‐线性化自杀质粒p6suigusA::Δvdh，实现在Δvdh‐位点的整合；

(b10)将得到的质粒p6suiΔvdh::permE*::echfcs转运至拟无枝酸菌属ATCC 39116Δvdh；

(b11)根据正确基因型选择拟无枝酸菌属ATCC 39116的转化体并培养得到第二重组子。