[发明专利]阿魏酸转化为香草醛的方法

说明书

发明领域

本发明属于生物技术领域并且涉及一种通过遗传工程改造的微生物将阿魏酸转化为香草醛的改善的发酵方法。

现有技术

香草醛以多于16000吨的全球年需求量是最重要的香料化合物之一。其被广泛用于各种应用，如生产香料、药物、食品和饮料。大量(99％)工业使用的香草醛是由木脂素和原油衍生物化合物合成的，因为由扁叶香果兰(Vanilla planifolia)的荚提取香草醛非常昂贵并且是劳动密集的。尽管化学合成的香草醛可以以非常诱人的价格生产，人们对基于生物技术方法的天然香草醛的生产非常感兴趣。由于消费者日益关注“天然”、“健康”和“有机”产品，与化学产生的香料相比天然香料具备更高的经济价值。这导致广泛研究基于可再生物质以环境友好的方法生产有价值的化合物。

香草醛和其他结构相关的酚类化合物除了用作香料制剂，表现出抗微生物和抗氧化性能，并因此也可用于各种制药应用和用作防腐剂。特别地该生物活性功能取决于正确的立体化学。生物催化是高度立体、区域和化学特异性的，而合成生产会导致外消旋混合物和非预期的副产物。此外，化学方法通常面对环境问题的反应条件以及产生有害废物的问题。

放线菌拟无枝酸菌属(Amycolatopsis sp.)ATCC 39116在发酵过程中对于香草醛具备优异的忍受性，因此可工业应用于由阿魏酸生产天然香草醛，以及其他结构相关的化合物。阿魏酸是植物世界中最丰富的羟基肉桂酸，因为它是高等植物细胞壁的主要成分。在这种情况下香草醛可以被标记为“天然香料”，因为它是由植物源提取或“通过适当的物理、酶或微生物方法由植物、动物或微生物源材料得到”。

不幸的是，由于有机体代谢作用中的解毒作用或分解，微生物生产的香草醛通常会快速的转化以提供碳源和能量源。因此，为了在不能降解香草醛的模型有机体如大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母(S.cerevisiae)中创建香草醛生产途径，进行了大量研究。然而，这些方法并不能工业应用，因为细菌对产品没有足够的忍受性。

为了使微生物生产具备经济吸引力，首先努力调节拟无枝酸菌属ATCC 39116的代谢实现香草醛的高效积累[Fleige et al.“Investigation of the Amyolatopsis sp.Strain ATCC 39116 vanillin dehydrogenase and its impact on the biotechnical production of vanillin”,Appl.Environ.Microbiol.79,p 81‐90(2013)]。

阿魏酸在拟无枝酸菌属ATCC 39116以及许多生产香草醛的菌株中的分解代谢，通过与两步酶法得到的香草醛一致的依赖辅酶A的非β‐氧化途径进行。这两种反应分别通过阿魏酰辅酶A合成酶(Fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(Ech)催化(2、6、7、14‐17)。香草醛随后通过香草醛脱氢酶(Vdh)进一步转化为香草酸。拟无枝酸菌属ATCC 39116缺失编码基因(vdh)导致显著提高的香草醛积累，以及生物转化实验中减少多于90％的分解代谢。

参考Appl.Environment.Microbiol.79(1),p 81‐90(2012)，其公开了拟无枝酸菌属ATCC 39116的vdh缺失突变体用于将阿魏酸转化为香草醛。然而该突变体不表现出任何香草醛脱氢酶活性，但表现出对卡那霉素的抗性。

为了得到拟无枝酸菌属ATCC 39116的高效基因调控，研发了新的分子工具[Fleige et al.“Construction of expression vectors for metabolic engineering of the vanillin‐producing actinomycete Amycolatopsis sp.Strain HR167 genes…”,Appl.Microbiol.Biotechnol.10.1007/s00253‐014‐5724‐5(2014)]。使用自杀质粒和表达载体实现了这种有前途的生产菌株的基因组的遗传修饰。

因此，本发明解决的问题是研发一种将阿魏酸转化为香草醛的改善的发酵方法，其具备更高的产率。更特别地本发明涉及拟无枝酸菌属微生物新陈代谢的改进，从而设计一种用于天然香草醛的有效生产菌株。

发明内容

本发明的第一个目标是将阿魏酸转化为香草醛的拟无枝酸菌属ATCC 39116菌株–突变体F33或突变体F84。该培养物根据以下方法得到，其包括以下步骤：