[发明专利]从ΔG的浓度依赖性来测定蛋白质聚集

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求享有在2014年07月21日提交的美国临时专利申请号62/026,984和在2014年08月07日提交的美国临时专利申请号62/034,504的优先权。上述专利申请的内容以引用的方式全部并入本申请。

背景技术

蛋白质聚集是影响蛋白质制备，特别是生物学上的长期稳定性的主要问题。通常，聚集体源自在制剂中存在的少量变性或部分变性的蛋白质。这些蛋白质构象倾向于聚集，例如，当蛋白质的疏水核心逐渐暴露于溶剂时。变性蛋白质的聚集逐渐使蛋白质的平衡向增加数量的变性和最终聚集的变性蛋白质移动。在其他情况下，天然状态本身可以显示聚集的倾向，由于连接的小分子药物通常是高度疏水的，这在抗体药物偶联物(ADC’s)中是一种加剧的倾向。

因此，存在用于识别和表征蛋白质聚集过程新方法和系统的需求。这样的方法和系统将在(1)鉴定和选择具有最小化聚集和延长长期稳定性的蛋白质制剂和(2)鉴定具有最低聚集倾向的蛋白质变体中提供了极大的益处。本申请解决了这种需求。

发明内容

本发明涉及在尽可能早的时间中确定和表征蛋白质聚集过程的方法和系统以及这些新方法和系统的用途，于(1)鉴定和选择具有最小化聚集和延长长期稳定性的蛋白质制剂，和(2)鉴定具有最低聚集倾向的蛋白质变体。

本发明的第一方面涉及基于所述溶液的蛋白质浓度的溶液中用于蛋白质聚集的量或分数的方法。该方法包括以下步骤：(1)提供包含增加浓度的蛋白质的若干第一溶液；(2)测量若干第一溶液中每个溶液的可观察的特征；(3)基于可观察的属性，确定若干第一溶液中每种浓度下蛋白质的构象稳定性的ΔG；(4)创建ΔG与每种浓度的蛋白质之间的相关性；和(5)使用相关性来确定被聚集的蛋白质的量和/或分数和/或被变性的蛋白质的量和/或分数。

如本文所述，“变性”是这样的过程，其中蛋白质通过施加一些外部应力或试剂，例如强酸或碱、浓缩的无机盐、有机溶剂、辐射或热，从而失去存在于其天然状态中的四级结构，三级结构和二级结构。常用的化学变性剂包括尿素和盐酸胍。活细胞中的蛋白质变性可导致细胞活性的破坏和可能的细胞死亡。在体内或体外，变性蛋白质可以表现出宽范围的特征，从构象变化和溶解性的降低到由于疏水基团的暴露导致的聚集。在该过程中，未折叠的蛋白质的暴露的疏水部分可以与其它未折叠的蛋白质的暴露的疏水部分相互作用，自发地导致蛋白聚集。

如本文所述，“蛋白质聚集”是蛋白质在细胞内或细胞外(包括体外)聚集(即，积累和簇集)的现象。当药学上可接受的制剂中的蛋白质聚集时，制剂的有效剂量减少，并且它们可能引起不希望的免疫应答。蛋白质可以在其天然状态或变性状态下聚集。

ΔG，通过评估蛋白质对增加量的物理或化学变性剂的抗性来测量以确定蛋白质的结构稳定性和/或构象稳定性的热力学参数。物理因子是温度或压力。在这种情况下，通过逐渐增加蛋白质溶液的温度或压力来实现变性。化学因子是变性剂分子，如尿素或盐酸胍。在这种情况下，蛋白质变性通过逐渐增加变性剂的浓度来实现。蛋白质的变性伴随着蛋白质的一些可观察的特征的变化。这些变化的分析用于评估ΔG。在实施方式中，若干溶液将不含有化学变性剂或化学变性剂的浓度不足以产生可检测水平的变性蛋白质。

在一些实施方式中，可观察的特征是荧光性。当蛋白质变性时，蛋白质的某些可测量的特征也会改变。一个这样的特征是蛋白质的荧光性。荧光性可以是蛋白质固有的，例如通过天然荧光的氨基酸，例如色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，或者可以于蛋白质是外来的，例如通过包含荧光标记的探针。可以使用其它本领域已知的方法来检测蛋白质的变性状态和/或允许测定ΔG。除了荧光光谱学之外，有许多物理可观察的特征和其使用的仪器，其对蛋白质的变性程度敏感。这些可观察的特征可以通过各种技术测量，包括但不限于uv/vis光谱、圆二色性、核磁共振(NMR)、红外光谱(IR)和差示扫描量热法等。

在一些实施方式中，所述方法可以进一步包括以下步骤：(1)提供包括增加浓度的蛋白质的若干至少第二溶液；(2)测量若干至少第二溶液中的每种溶液的可观察的特征；(3)基于可观察的特征，确定若干至少第二溶液中每种浓度的蛋白质的构象稳定性的ΔG；(4)创建于每个若干至少第二溶液的ΔG与蛋白质的每种浓度之间的相关性；和(5)使用相关性来确定若干至少第二溶液中聚集的蛋白质的量和/或分数和/或变性的蛋白质的量和/或分数。

在实施方式中，所述方法包括将若干第一溶液中每种浓度的蛋白质的构象稳定性的ΔG与若干至少第二种溶液中每种浓度的蛋白质的构象稳定性的ΔG进行比较的步骤。