[发明专利]疏水性肽的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及简便地对键合了载体的粗制肽进行纯化而制造纯化肽的方法、以及适于该纯化肽的制造方法的接头。

背景技术

作为化学合成肽和蛋白质的方法，作为代表性的方法已知有：用聚苯乙烯高分子凝胶珠等作为固相，对其反复进行氨基酸的缩合反应和末端保护基的脱保护，由此使肽链依次延长的固相合成法；以及，在液相中反复进行氨基酸的缩合反应和末端保护基的脱保护，由此使肽链延长的液相合成法。其中，固相合成法中高分子凝胶键合于生成的肽链而不溶，因此可通过过滤等除去原料试剂等可溶性杂质，容易进行粗纯化。然后，对于通过除去高分子凝胶而得到的肽而言，在其为亲水性的情况下，可以利用反相HPLC等进一步进行纯化。然而，在生成的肽为疏水性的情况下，无法用反相HPLC进行纯化，产生难以高纯度化的问题。

作为固相合成的疏水性肽的纯化技术，已知如下方法：一方面从疏水性肽上切断除去固相载体，另一方面使亲水性肽键合，在暂时使疏水性肽亲水化而实施了HPLC纯化后，切断除去该亲水性肽，获得高纯度的疏水性肽。例如，专利文献1中记载了通过应用生物技术而使亲水性肽键合于疏水性肽的技术。但是，在利用生物技术的情况下，其制造效率受到目标疏水性肽的序列的很大影响，有时难以大量生产，存在缺乏技术通用性的问题。

作为将亲水性氨基酸连续地键合于疏水性肽并进行亲水化、HPLC纯化的技术，除了上述使用了生物技术的肽制造方法以外，还已知：利用了Boc固相合成法的技术(非专利文献1)、利用了Fmoc固相合成法的技术(非专利文献2～5等)。在采用这些化学方法形成肽的情况下，由于连续地反复进行氨基酸的保护基的脱保护和肽合成，因此不需要在氨基酸脱保护反应条件下切断疏水性肽与固相载体之间的键。例如，在Boc固相合成法中，为了用作为强酸的TFA对氨基酸的保护基进行脱保护，而使疏水性肽与固相载体之间的键具有耐强酸性。该疏水性肽与固相载体的键的切断通常使用HF。但是，HF危险且有害，需要特殊的制造装置。

在Fmoc固相合成法中，由于可以在碱性条件下进行脱保护，因此与固相载体的键合方法的自由度高。例如，在非专利文献2、3中公开了如下方法：用Fmoc固相合成法在固相载体上合成亲水性肽，接着在其N末端侧键合4-羟甲基苯甲酸作为接头，再用Fmoc固相合成法合成疏水性肽。在该方法中，固相载体与肽链容易切断，而且接头的羟基侧(疏水性肽键合侧)也容易切断。但是，在该方法中，难以根据目标肽(疏水性肽)的氨基酸序列而适当变更亲水性肽，缺乏方法的通用性。另外，在从接头的羟基侧除去亲水性肽时需要强碱性条件。因此，存在因以天冬酰亚胺(aspartimide)化为代表的副反应所导致的纯度降低的隐患，也存在得到的疏水性肽的C末端侧的形态仅限于羧酸的问题。

非专利文献4和5的方法为相同的Fmoc固相合成法，而且在能够用固相合成法先合成疏水性肽(目标肽)方面比上述非专利文献2、3的方法更优异。该方法需要在合成N末端具有亲水性肽和亚苯基型化合物的氨基酸之后完成疏水性肽的序列。因此，由于每个疏水性肽需要N末端具有亲水性肽和亚苯基型化合物的氨基酸，可以认为是繁琐的工艺。另外，最终得到的疏水性肽无法使N末端侧为半胱氨酸、蛋氨酸，缺乏通用性。另外，在该方法中，难以根据目标肽(疏水性肽)的氨基酸序列而适当变更亲水性肽，在这一方面也缺乏方法的通用性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平07-102000号公报

非专利文献

非专利文献1：Englebretsen、D.R.等著、Tetrahedron 1999、55、6623；

非专利文献2：Hossain、M.A等著、Bioconjutgate.Chem.2009、20、1390；

非专利文献3：Choma、C.T.等著、Tetrahedron Letters 1998、39、2417；

非专利文献4：Vorherr、T.著、Chimica Oggi 2007、25、22；

非专利文献5：Dick、F等著、Eur.Pept.Symp.29th、Gdansk 2006、Post e Th009。

发明内容

发明要解决的课题

因此，本发明的目的在于提供一种制造方法，该方法在用亲水性单元对固相合成的疏水性肽进行亲水化并进行HPLC纯化时，能够不依赖于N末端的氨基酸残基的种类而以全部疏水性肽作为纯化对象，且疏水性肽的C末端侧的形态不受羧酸的限制，另外，可以根据疏水性肽的种类而随机应变地选择亲水性单元，而且通用性优异。