[发明专利]合成核酸的方法和设备

说明书

相关申请

本申请要求2014年10月27日提交的美国临时专利申请第62/069,067号和2014年8月18日提交的美国临时专利申请第62/038,604号的优先权及权益。每一以上申请的公开内容均以其全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及合成具有所需序列的聚核苷酸(从头)且不需要模板的方法和设备。由此，本发明能够制造具有变化序列和变化长度的聚核苷酸文库以用于研究、基因工程以及基因疗法。

背景技术

基因工程需要确定基因材料的含量的工具以及构筑所需基因材料的工具。确定基因材料的含量的工具使得可以在低于$1,000下在约一天内对整个人类基因组测序。(参见生命技术，新闻稿：Benchtop Ion Proton^TM测序仪，2012年1月10日(Life Technologies,Press Release:Benchtop Ion Proton^TM Sequencer,January 10,2012))。相反，构筑所需基因材料(例如从头DNA合成)的工具并未同步改进。作为参照点，在过去的25年，小核酸从头合成的成本(每个碱)下降10倍，同时核酸测序的成本(每个碱)下降10,000,000倍以上。DNA合成缺乏进展目前限制了转译基因组学的步伐，即，由此确定个别序列变异的作用并且用以改进治疗性治疗。

目前，大多数新生核酸序列使用30多年前研发的固相亚磷酰胺技术合成。所述技术涉及由与天然(或非天然)核酸碱基对应的亚磷酰胺试剂构建的序列的依序去保护和合成。亚磷酰胺核酸合成长度受限，然而，这是因为长度大于200个碱基对(bp)的核酸会历经高断裂率和副反应。另外，亚磷酰胺合成会产生有毒副产物，并且这一废弃物的处置限制核酸合成器的可用性，并且增加合同寡核苷酸制造成本。(估计每年对寡核苷酸合成的需要会造成大于300,000加仑的有害化学废弃物，包括乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氢呋喃以及吡啶。参见勒普罗斯特(LeProust)等人，核酸研究，第38(8)卷，第2522-2540页，(2010)(Nucleic Acids Res.,vol.38(8),p.2522-2540,(2010))，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，需要更有效并且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。

发明内容

本发明提供改进的核酸合成方法。本发明方法提供更快并且更长的聚核苷酸从头合成。由此，本发明大大降低合成常规核酸的总成本。本发明方法是针对使用核苷酸基转移酶来并入未经修饰的3'羟基通过可裂解连接子与抑制因子偶联的核苷酸类似物而不依赖模板地合成聚核苷酸。由于存在抑制因子，合成因添加每一新的碱基而停顿，因此连接子发生裂解，从而分离抑制因子并且离开聚核苷酸，这与天然产生的核苷酸本质上相同(即，通过酶识别为进一步核苷酸并入的底物)。

本发明另外包括利用本发明方法产生定制聚核苷酸的设备。本发明的设备包括提供水性条件的一个或多个生物反应器和多个核苷酸类似物来源。生物反应器可以是例如储槽、流槽或多孔板。以固体支撑物起始，通过经由核苷酸基转移酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或无模板指向使DNA或RNA链伸长的任何其它酶)的天然活性添加连续核苷酸使聚核苷酸生长于反应器中。在连接子裂解时，天然聚核苷酸暴露于固体支撑物上。一旦序列完整，支撑物就会裂解掉，留下聚核苷酸，其实质上相当于自然界中所见的聚核苷酸。在一些实施例中，将设备设计为通过在核苷酸添加之后回收溶液并且将溶液再用于子序列核苷酸添加来回收核苷酸类似物溶液。因此，产生较少废弃物，并且，与目前先进技术方法相比每个碱基的总成本降低。在某些实施例中，生物反应器可以包括微流体装置和/或使用喷墨印刷技术。

封端基团可以包括(例如)带电部分或空间抑制因子。一般来说，防止核苷酸基转移酶达成功能构形的大分子可以用以抑制寡核苷酸合成。此类大分子可以包括聚合物、多肽、类多肽以及纳米粒子。大分子应该足够大以从物理上阻止接近核苷酸基转移酶的活性位点，但又不会大到对反应动力产生不利改变。大分子可以使用多个连接分子连接到核苷酸类似物，如下所述。