[发明专利]在分泌弗林蛋白酶的哺乳动物表达系统中产生被完全加工且功能性的因子X

权利要求书

1.转化细胞，其包含：

编码人弗林蛋白酶的第一核苷酸序列和编码人因子X的第二核苷酸序列，以使得该转化细胞向培养物上清液中表达并分泌功能性弗林蛋白酶和因子X，其中所述弗林蛋白酶在培养36至78小时后在培养物上清液中以50 U/mL至173.37 U/mL的浓度分泌，且至少73.47%的因子X是被完全加工的。

2.根据权利要求1的转化细胞，其中编码人弗林蛋白酶的核苷酸序列和编码所述蛋白质的核苷酸序列位于不同表达载体上或位于相同表达载体上。

3.根据权利要求1或2的转化细胞，其中所述表达载体为病毒载体或非病毒载体。

4.根据权利要求1的转化细胞，其中所述功能性弗林蛋白酶在培养36至78小时后在培养物上清液中以50 U/mL至60 U/mL的浓度分泌。

5.根据权利要求4的转化细胞，其中由所述转化细胞产生的至少90%的因子X是被完全加工的。

6.根据权利要求1的转化细胞，其中所述功能性弗林蛋白酶在培养36至78小时后在培养物上清液中以90 U/mL至100 U/mL的浓度分泌。

7.根据权利要求6的转化细胞，其中由所述转化细胞产生的至少95%的因子X是被完全加工的。

8.制备重组蛋白质的方法，其包括：

用适于通过细胞系表达人弗林蛋白酶的第一表达载体转染适于表达哺乳动物蛋白质的细胞系，其中所述第一表达载体包含编码人弗林蛋白酶多肽的核苷酸序列；和

用适于通过细胞系表达因子X的第二表达载体转染该细胞系，其中所述第二表达载体包含编码因子X多肽的核苷酸序列；

其中用第一和第二表达载体转染的细胞系在培养36至78小时后，以50 U/mL至173.37U/mL的浓度向培养物上清液中表达并分泌功能性人弗林蛋白酶，且至少73.47%的因子X是被完全加工的。

9.根据权利要求8的方法，其中在培养36至78小时后，所述功能性弗林蛋白酶以50 U/mL至60 U/mL的浓度通过所述细胞系被分泌到培养物上清液中。

10.根据权利要求8的方法，其中在培养36至78小时后，所述功能性弗林蛋白酶以90 U/mL至100 U/mL的浓度通过所述细胞系被分泌到培养物上清液中。

11.根据权利要求10的方法，其中由所述细胞系产生的至少95%的因子X是被完全加工的。

12.根据权利要求9的方法，其中同时用所述第一表达载体和第二表达载体转染所述细胞系。

13.根据权利要求9的方法，其中用第一表达载体转染所述细胞系，且在用第二表达载体转染所述细胞系之前获得分泌稳定水平弗林蛋白酶的细胞。

14.根据权利要求9的方法，其中用所述第二表达载体转染所述细胞系，且在用所述第一表达载体转染所述细胞系之前获得分泌稳定水平蛋白质的细胞。

15.产生成熟的、被完全加工的FX的方法，包括培养权利要求1-7中任一项的转化细胞以从培养物上清液中产生成熟的、被完全加工的因子X。