[发明专利]在分泌弗林蛋白酶的哺乳动物表达系统中产生被完全加工且功能性的因子X

说明书

本发明公开了在表达系统中产生完全加工的成熟因子X的方法，其以50U/mL培养物上清液至300U/mL培养物上清液产生受控量的弗林蛋白酶。还公开了用于表达弗林蛋白酶和因子X的转化细胞、表达系统和表达载体。

技术领域

本发明公开的是，在弗林蛋白酶的存在下，用于表达被完全加工的且有活性的重组因子X的表达系统、转化细胞及其相关方法。

背景介绍

人凝血因子X(FX)、活化的FX(FXa)及其变体被用作血液凝固病症(包括，但不限于，血友病和血管性血友病)的治疗剂。FX是一种维生素K-依赖性丝氨酸蛋白酶，其在内质网中作为单链前体蛋白而被合成，随后在高尔基体中进行细胞内蛋白水解的弗林蛋白酶裂解，然后通过向血流中产生细胞或者在重组表达的情况下向培养基中产生细胞。FX中的三个弗林蛋白酶裂解位点负责恰当的FX蛋白酶解加工。FX的成熟形式是二硫键连接的双链分子，其由重链和轻链组成，在前体蛋白裂解后形成。该分子的进一步修饰包括轻链的γ-羧基化和连接到重链的活化肽的N-和O-连接的糖基化。

除了FX外，具有共有识别位点Arg-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO:4)的其他维生素K依赖性凝血因子是普遍表达的内切蛋白酶弗林蛋白酶的底物，也被称为成对碱性氨基酸残基切割酶(PACE)。由于高产量表达下细胞内加工的限制，细胞培养物表达系统中对凝血级联重组蛋白的适当的蛋白酶解加工受损。类似于血管性血友病因子和凝血因子IX(FIX)，其在重组哺乳动物细胞中呈现出高表达率下不足的蛋白酶解加工，低产量CHO细胞克隆中的FX分泌的特征在于被完全加工的FX，而除了被正确加工的FX重链和轻链种类外，高产量的克隆包含未加工的单链FX以及多种未加工形式的FX轻链。未加工的FX轻链的种类和程度在各细胞克隆之间以及在不同细胞培养条件(如细胞密度)下各不相同。需要额外的体内弗林蛋白酶共表达或后细胞(post-cell)体外培养弗林蛋白酶培养来支持内源性弗林蛋白酶蛋白水解机制，从而促进完整的蛋白质裂解。

弗林蛋白酶的共表达对于高产率下被完全加工的FX表达来说是必不可少的。然而，到目前为止，尚未报道弗林蛋白酶的阈水平可确保在细胞培养物系统中被完整加工的FX的高百分比。高浓度的弗林蛋白酶是有毒的，因此由产生FX的哺乳动物表达系统的弗林蛋白酶表达水平必须在有毒、但可能加工100％的FX前体蛋白，和那些极低、因而导致在健康的细胞培养物中生产次优加工的FX的水平之间保持平衡。

发明内容

本发明公开了用于在相同细胞系中表达弗林蛋白酶和人因子X(FX)的系统，从而在培养物上清液中提供关键的弗林蛋白浓度，以产生被完全加工且具有完全活性的FX，同时保持该培养物的活力。

因此，本发明公开了转化细胞，其包含编码人弗林蛋白酶的核苷酸序列，使得该转化细胞向培养物上清液中表达并分泌功能性弗林蛋白酶，其中该功能性弗林蛋白酶在培养约36小时至约78小时后以在培养物上清液中以约50U/mL至约300U/mL的浓度分泌。在一个实施方案中，该转化细胞还包含核苷酸序列，其编码可被弗林蛋白酶裂解并呈现出Arg-(Lys/Arg)-Arg基序的蛋白质。在另一个实施方案中，编码人弗林蛋白酶的核苷酸序列和编码该蛋白质的核苷酸序列位于不同的表达载体上。在另一个实施方案中，编码人弗林蛋白酶的核苷酸序列和编码该蛋白质的核苷酸序列位于相同的表达载体上。

还提供了包含适于表达哺乳动物蛋白质的细胞系的真核蛋白表达系统；适于通过细胞系表达人弗林蛋白酶的第一表达载体，其中所述第一表达载体包含编码人弗林蛋白酶多肽的核苷酸序列；和适于通过细胞系表达蛋白质的第二表达载体，其中所述第二表达载体包含编码可被弗林蛋白酶裂解并呈现出Arg-(Lys/Arg)-Arg基序的蛋白质的核苷酸序列，其中所述细胞系能够在培养约36至约78小时后以约50U/mL至约300U/mL的浓度将功能性弗林蛋白酶分泌到培养物上清液中。