[发明专利]基于Gβγ互作蛋白监测G蛋白激活的生物传感器

说明书

描述了用于评估G蛋白活性的基于共振能量转移(RET)或蛋白片段互补测定的生物传感器。这些生物传感器基于Gα亚基和Gβγ互作蛋白之间竞争结合于Gβγ二聚体。这些生物传感器包括：与适当的RET或PCA标记融合的(1)βγIP和(2)Gβ或Gγ蛋白；GPCR；或质膜靶向域。还描述了使用这样的传感器用于不同的应用的方法，所述应用包括对调节G蛋白活性的试剂的鉴别或对GPCR信号传导/调节的表征的鉴别如GPCR的G蛋白偏好和激活谱。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年10月14日提交的美国临时申请号62/063,622的权益，其通过引用全文并入本文。

技术领域

本发明涉及对G蛋白激活的监测，更特别地涉及用于检测G蛋白激活的信号传导生物传感器。

背景技术

异源三聚体G蛋白由三个亚基组成：α、β和γ，该异源三聚体G蛋白向各种胞内效应物传递由G蛋白偶联受体(GPCR)提供的信息。在缺乏刺激的情况下，G蛋白的α-亚基与GDP(鸟苷二磷酸)分子形成复合体。配体激活受体后的构象变化促进了GDP分子磷酸化为GTP(鸟苷三磷酸)。结合GTP的Gα亚基与Gβγ亚基解离，然后两者能够与下游效应物相互作用和调节下游效应物的活性。因此，使用Gβγ互作蛋白，通过下游效应物与Gβγ的相互作用分析下游效应物来评估G蛋白的激活。在Gα亚基将GTP水解为GDP后，Gα对Gβγ的亲和力恢复，并且三个亚基重结合，形成无活性的异源三聚体G蛋白，结束效应物的参与，从而发生信号转导(Gilman 1987)。

除了GPCR对G蛋白的经典激活以外，其他蛋白质也可以调节这些异源三聚体G蛋白的活性，如G蛋白信号传导调节因子(RGS)、G蛋白信号传导激活因子(AGS)和抗胆碱酯酶8蛋白抑制因子(resistance to inhibitors of cholinesterase 8 proteins，Ric-8)。在这些非典型信号转导通路中的某些中，另一种蛋白(例如Ric-8)替代了由GPCR经典地发挥的鸟嘌呤交换因子(GEF)活性(Boularan和Kehrl，2014)。

G蛋白偶联受体激酶(GRKs)2和G蛋白偶联受体激酶3首先以其在受体脱敏中的作用为特征，其也是通过与Gβγ亚基的相互作用参与的效应物。GRK2和GRK3含有普列克底物蛋白同源(PH)域，所述普列克底物蛋白同源(PH)域在G蛋白的Gβγ亚基与激活的结合GTP的Gα亚基解离时，与G蛋白的Gβγ亚基相互作用(Pitcher，Inglese等人.1992)(Touhara，Inglese等人.1994)。因此，Gβγ互作蛋白(βγIP)(如GRK2和GRK3)可以用于直接研究GPCR或其他G蛋白激活因子对G蛋白的激活。

当前，药物开发工业中使用几种方法评估GPCR的激活和由此评估受体连接G蛋白，如钙动员测定或基于通过G蛋白结合的GTPγS的放射性测定。钙动员测定测量发生在Gq激活下游的信号传导事件，并且仅当与使用修饰的Gα亚基偶联时可以应用于Gi偶联受体或Gs偶联受体。在GTPγS结合测定的情况下，使用放射性GTPγ³⁵S在细胞膜上直接测量各种异源三聚体G蛋白的激活，该异源三聚体G蛋白的激活不能在活细胞中进行。

由此，到目前为止尚未探索在不修饰G蛋白的激活因子或Gα亚基的情况下在活细胞中激活G蛋白。此外，已知的方法不适合于使用相同的检测配偶体研究所有不同的G蛋白。这样的测定在药物开发过程的不同阶段中是尤其有用的，例如，通过使G蛋白偶联谱能够表征和促进对具有限定的信号传导特性的新化合物的鉴定以用于筛选测定和结构-活性关系研究。这是尤其真实的，因为G蛋白激活因子作为药物靶标的重要性，其占所有通过GPCR起作用的处方药中的26％(Garland 2013)。尽管有几种方法可以用于支持开发新的靶向G蛋白激活因子的治疗活性分子，但那些化合物的精确作用机制的可用信息的缺乏常常限制新型药物的发现。

因此，存在新的评估G蛋白激活的工具和测定的需求。

本说明书参考许多文献，所述文献的内容通过引用全文并入本文。