[发明专利]用于核酸检测的方法和组合物

权利要求书

1.用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法，所述方法包括：使所述样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应，其中所述反应混合物包含：

（a）环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A、接头序列D和序列B；其中所述环引物经由下述与靶多核苷酸特异性杂交：（i）所述环引物的序列A与所述靶多核苷酸上的序列A'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B与所述靶多核苷酸上的序列B'之间的序列互补性，其中序列A'和序列B'在所述靶多核苷酸上5'至3'定向；和

（b）聚合酶，其沿所述靶多核苷酸从5'至3'延伸所述环引物的序列B，所述靶多核苷酸充当用于模板引导的引物延伸的模板，以产生所述靶多核苷酸的互补序列，

其中所述接头序列D包含发夹结构。

2.权利要求1的方法，其进一步包括在反向引物和正向引物存在下，扩增权利要求1的产物，其中所述反向引物与序列特异性杂交，所述序列与相对于序列A'或B'为5'的所述靶多核苷酸的一部分互补，并且所述正向引物与所述接头序列D中的序列特异性杂交。

3.权利要求2的方法，其进一步包括检测所述核酸扩增的产物，并且其中所述检测步骤包括检测来自与所述产物具有序列互补性的所述反应混合物中的探针的信号。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中序列A为长度2nt至10nt，并且序列B为长度2nt至10nt。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述序列A和B的组合长度为5nt至20nt。

6.权利要求1至3中任一项的方法，其中当最佳比对时，序列B和A的线性串联与序列A'和B'的线性串联至少80%互补。

7.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述序列A'的3'端在序列B'的1nt至5nt内。

8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述靶多核苷酸是非编码RNA分子，并且其中所述非编码RNA分子选自：成熟微小RNA分子、前体微小RNA分子、初级微小RNA分子、siRNA分子、piRNA分子、piwiRNA、lncRNA、rRNA和shRNA分子。

9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述接头序列D包含选自下述的一种或多种序列元件：一种或多种条形码序列；一种或多种限制性酶识别序列；一种或多种寡核苷酸探针结合序列或其互补体；一种或多种测序引物退火序列或其互补体；和这些的组合。

10.用于检测样品中少数等位基因的存在的方法，所述少数等位基因是与在单个碱基位置处更丰富的相应等位基因不同的序列变体，所述方法包括：使所述样品在反应混合物中在扩增少数等位基因和包含序列变体的更丰富的等位基因的区域的条件下，经历使用一对环引物的核酸扩增反应，其中反应混合物包含：

（a）第一环引物，其包含在单链上从5'到3'定向的序列A1、接头序列D1和序列B1；其中所述第一环引物经由下述与所述少数等位基因特异性杂交：（i）所述环引物的序列A1与所述少数等位基因上的序列A1'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B1与所述少数等位基因上的序列B1'之间的序列互补性，其中序列A1'和序列B1'在所述少数等位基因上5'至3'定向；

（b）第二环引物，其包含在单链上从5'至3'定向的序列A2、接头序列D2和序列B2；其中所述第二环引物经由下述与更丰富的等位基因特异性杂交：（i）所述环引物的序列A2与所述更丰富的等位基因上的序列A2'之间的序列互补性，和（ii）所述环引物的序列B2与所述更丰富的等位基因上的序列B2'之间的序列互补性，其中序列A2'和序列B2'在所述更丰富的等位基因上的5'至3'定向；和

（c）聚合酶，其将所述第一和第二环引物的序列B1和序列B2沿分别的等位基因从5'延伸至3'，所述等位基因充当模板引导的引物延伸的模板，以产生分别的等位基因的互补序列，

其中所述接头序列D1和D2各自包含发夹结构。