[发明专利]用于核酸检测的方法和组合物

说明书

提供用于产生关于样品中的靶多核苷酸中的区域的互补序列的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统。在一些方面，所述方法、组合物、反应混合物、试剂盒和/或系统包括使所述样品在反应混合物中在产生关于靶多核苷酸区域的完全序列的条件下经历核酸扩增反应。在一些方面，扩增所产生的互补序列。

交叉参考

本申请要求于2014年8月19日提交的美国临时申请号62/039,207的利益，所述申请通过引用并入本文。

发明背景

小的非编码RNA在许多生物中充当重要的基因表达调节剂。He等人，Nat RevGenetics 2004，5（7）: 522-31。例如，已在植物和动物，包括人、小鼠、果蝇（Drosophila）和秀丽隐杆线虫（C. elegans）中鉴定了几百种微小RNA（miRNA）（Bino等人，2004，PLoS Biol.2（11）: e363）。具体地，已显示单链miRNA与不同人类疾病相关，例如生物过程如细胞凋亡、增殖、上皮细胞形态发生、神经和肌肉细胞分化中的缺陷，脂肪/胆固醇/葡萄糖稳态和病毒感染相关。参见例如，Esquela-Kerscher A Slack FJ，Nat. Rev. Cancer，2006，6（4）:259-69；Michael等人，Mol. Cancer Res.，2003，1（12）: 882-91；Dimmeler S NicoteraP，EMBO Mol. Med. 2013，5（2）: 180-90。近期发现提示影响这些过程的许多miRNA在循环系统中是丰富和稳定的，这使得miRNA和其他类似的调节性小非编码RNA是用于疾病诊断和鉴定的无价生物标记物，以及潜在的治疗靶。Brase JC等人，Mol. Cancer 2010，26（9）:306；Chen等人，Cell Res. 2008，18（10）: 997-1006。

然而，小RNA（包括微小RNA）由于许多原因而难以检测和定量。首先，小RNA很短；例如，微小RNA通常约20个核苷酸长，这大致是常规PCR引物的长度。这使得PCR扩增非常困难，所述PCR扩增是用于检测和定量的重要方法。其次，许多小RNA密切相关；例如，相同miRNA家族的许多成员是非常保守的，并且有时仅相差一个核苷酸。这使得准确分析特定小RNA的影响变得困难。

已设计了几种常规技术来满足这种需要，并且所有这些技术都具有许多严重的缺点。例如，第一种方法是基于茎环的RT-PCR。Chen等人，Nucleic Acids Res. 2005，33（20）:e179。在该方法中，茎环形状的RT引物结合miRNA的最后6个核苷酸并生成延长的cDNA。然后通过miRNA特异性正向引物和通用反向引物扩增该延长的cDNA。在RT-PCR期间，推测通过TaqMan探针确保定量的准确性。然而，使用该方法的缺点是缺乏特异性，因为用户不能利用解链曲线分析来控制特异性。此外，TaqMan探针结合由RT引物贡献的序列，其不一定是miRNA独有的。

第二种方法利用对miRNA的聚A尾部，并且使用加上标签的聚T引物用于RT。Shi等人，Biotechniques 2005，39（4）: 519-25。然而，使用这种方法的缺点是多方面的。首先，具有共同3'端的小RNA可能被错误地聚腺苷酸化。其次，聚腺苷酸化的效率是未知的。第三，在小RNA端的2'-氧甲基修饰阻断该多聚腺苷酸化。例如，植物miRNA携带这种2-氧甲基修饰。因此，存在可以解决这些缺点中的一个或多个的替代系统的相当大的需求。

发明概述

能够特异性、准确地和/或廉价地检测和/或定量小的非编码RNA的有利系统和/或方法将克服上述技术障碍中的一个或多个。这样的系统和/或方法将极大地促进利用小的非编码RNA用于诊断或其他临床应用的全部潜力。