[发明专利]核酸分析

权利要求书

1.一种分析样品中存在或可能存在的靶标核酸中的单链靶标核酸序列的方法，所述方法包括下述步骤：

(i)提供一种询问双链体核酸结构，其包含：

(a)第一报道子链，其能够与靶标链(如果在样品中存在)中的单链靶标核酸序列特异性杂交，并且其在其一个末端处或对其一个末端用能够提供可检测信号的报道子结构部分标记，所述报道子链被这样设置，以使在通过所述第一报道子链与所述单链靶标核酸序列杂交所形成的报道子/靶标双链体结构中，所述报道子链可以从其与所述报道子结构部分相对的末端被选择性酶促消化，从而释放杂交的单链靶标核酸序列和所述报道子结构部分；和

(b)第二可替换的链，其短于所述第一报道子链，并且与第一报道子链杂交形成所述询问双链体核酸结构，其中所述报道子链提供询问突出端，

(ii)提供能够执行包含所述报道子链和靶标核酸序列的双链体结构中的报道子链的所述选择性酶促消化的酶，和

(iii)在如果存在单链靶标核酸序列，所述单链靶标核酸序列替换所述询问双链体核酸结构的第二链并且与所述报道子链杂交，随后酶促消化所述报道子链的条件下，进行分析，和

(iv)直接或间接地检测报道子结构部分的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中在所述样品中存在所述单链靶标核酸。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法等温实施。

4.如权利要求1或3中任一项所述的方法，其中通过所述第一报道子链和所述单链靶标核酸杂交形成的所述报道子/靶标双链体结构具有平端，并且所述报道子链的酶促消化从所述双链体结构的这一末端继续进行。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述靶标核酸链比所述报道子链长，并且形成所述报道子/靶标双链体结构中的“尾”。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述尾具有200个碱基的最大长度。

7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述平端位于所述报道子链的5’-端。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述报道子链的5’-端是磷酸化的。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述酶是λ-外切核酸酶。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述靶标核酸在使用具有5-磷酸化末端的引物实施的PCR反应中产生。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述询问双链体核酸结构中的突出端具有5-20个碱基。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述询问双链体核酸结构中的突出端具有7-20个碱基。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述询问双链体核酸结构中的突出端具有15-17个碱基，优选16个碱基。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述酶是λ-外切核酸酶，所述报道子链具有5’-磷酸化的末端，所述询问突出端具有15-20个碱基，并且反应等温进行。

15.如权利要求14所述的方法，其中，在所述报道子/靶标双链体结构中，所述靶标核酸链具有最大长度为100个碱基的尾。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述反应在35℃-40℃的温度、优选在37℃实施。

17.如权利要求14-16所述的方法，其中所述询问突出端具有15-17个碱基的长度。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述报道子结构部分是发光结构部分。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述第二可替换链提供有猝灭剂结构部分，以猝灭所述询问双链体核酸结构中所述报道子结构部分的发光。

20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述报道子结构部分是与底物反应时能够检测到信号的酶。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法在液相中实施。

22.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述询问双链体核酸结构凭借连接到固相上的所述第二可替换链而固定在所述固相上。